[發(fā)明專利]胚胎干細(xì)胞特有小分子多肽ES61編碼基因的克隆方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310753802.5
• 申請(qǐng)日: 2013-12-31
• 公開（公告）號(hào): CN103865920A
• 公開（公告）日: 2014-06-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張茂雷;陳杰
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣州達(dá)恩基因科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/10
• 分類號(hào): C12N15/10;C12N15/79
• 代理公司: 廣州新諾專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 44100
• 代理人: 張玲春;劉婉

1.一種胚胎干細(xì)胞特有小分子多肽ES61編碼基因的克隆方法，步驟如下：

（1）提取人絨毛組織總RNA，然后將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA；

（2）設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物將目標(biāo)基因擴(kuò)增出來(lái)；

（3）PCR產(chǎn)物的回收和純化；

（4）基因酶切、連接、轉(zhuǎn)化。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟（2）的具體操作為：在ES61后面添加HA標(biāo)簽序列，上下游引物兩端分別添加XhoI和HindIII限制性內(nèi)切酶序列，引物擴(kuò)增片段總長(zhǎng)度為234bp；將目標(biāo)片段克隆連接到PLEGFP-N1真核生物表達(dá)載體中，引物序列如下：

ES61-F:5'-CGGCTCGAGACCATGAACTCGCAGATGCCGCTC-3'

用上述引物配合如下反應(yīng)體系：PCR為50μl總體系，具體是5×Phusion?HF?Buffer10μl，2.5mM?dNTPmix5μl，10mM的上下游引物各2μl，2U/μl的Phusion?DNA聚合酶0.8μl，人絨毛組織cDNA模板2μl，用滅菌水補(bǔ)足50μl體系，反應(yīng)條件為“降落PCR”：95℃5min預(yù)變性，循環(huán)內(nèi)98℃10s變性，從68℃每個(gè)循環(huán)降1℃退火，72℃延伸20s,10個(gè)循環(huán)；在60℃退火，進(jìn)行25個(gè)循環(huán)；PCR反應(yīng)循環(huán)后72℃繼續(xù)延伸7min，然后16℃保存。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述步驟（4）中，用XhoI和HindIII酶對(duì)上述PCR產(chǎn)物和PLEGFP-N載體進(jìn)行雙酶切，酶切反應(yīng)體系如下：10X?Buffer4μl，DNA約2μg，內(nèi)切酶(10U/μl)各1μl，滅菌去離子水補(bǔ)足到40μl，反應(yīng)條件37℃、1hr。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述步驟（4）中，連接反應(yīng)體系如下：目的片段DNA2μl，PLEGFP-N1載體0.5μl，T4連接酶1μl，10X?T4Buffer1μl滅菌去離子水補(bǔ)足到10μl，22℃連接30min。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟（4）中，轉(zhuǎn)化步驟如下：取連接產(chǎn)物加到100μlDH5α感受態(tài)細(xì)胞中,混勻，冰浴30分鐘；將上述轉(zhuǎn)化液置于42℃水浴90秒，取出后立即置于冰浴中放置2-3分鐘；向其中加入900μl37℃預(yù)熱的LB培養(yǎng)基，150rpm、37℃振蕩培養(yǎng)45分鐘；2500rpm離心5min，將上清液吸走，留100μl混勻菌液，加到含Kana抗生素LB固體瓊脂培養(yǎng)基上，用無(wú)菌的彎頭玻棒輕輕的將細(xì)胞均勻涂開；待平板表面干燥后，倒置平板，37℃培養(yǎng)12-16小時(shí)。