[發明專利]一種幼海蜇基因組DNA的提取方法

無效

• 申請號: 201310753650.9
• 申請日: 2013-12-31
• 公開（公告）號: CN103667263A
• 公開（公告）日: 2014-03-26
• 發明（設計）人: 李云峰;赫崇波;李石磊;劉衛東;高祥剛;鮑相勃;蘇浩;高磊
• 申請（專利權）人: 遼寧省海洋水產科學研究院
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 大連東方專利代理有限責任公司 21212
• 代理人: 賈漢生;李馨

技術領域

本發明涉及腔腸動物門水母體一種組織DNA的提取方法，更具體的說涉及一種幼海蜇基因組DNA提取方法。

背景技術

DNA提取是分子生物學研究最基礎的技術，高質量的DNA是開展分子生物學后續研究的重要保證。對于水產動物基礎群體家系選育、分子標記輔助育種和遺傳多樣性等方面的研究，要求盡量保證群體個體成活并需要大量的研究個體，目前許多DNA提取方法已經不能很好地滿足這種要求；已報道的海蜇基因組DNA提取方法，操作復雜，耗時長，不利于大規模樣本的提取，而且無法保證個體的成活；幼海蜇是選擇育種研究中最重要的發育階段，其含水量高、自溶和再生等生物學特點，高質量的DNA提取難度較大，實驗研究中我們對幼海蜇不同組織器官進行基因組DNA的提取，發現DNA提取效果差異顯著，本發明提供一種簡單快速的幼海蜇DNA提取方法。

發明內容

本發明目的是提供一種簡單、經濟快速的幼海蜇DNA的提取方法，克服現有DNA提取方法存在的缺陷，由于幼海蜇不同組織因其細胞結構及所含的成分不同，從而導致不同組織器官基因組DNA提取效果存在明顯差異，本發明選擇幼海蜇觸手為研究對象，幼海蜇不需處死，適合大規模DNA的提取，該方法提取DNA純度高，能滿足后續PCR等分子生物學實驗的要求。

一種幼海蜇基因組DNA提取方法，包括以下步驟：

1）取幼海蜇觸手2～4根，放入95%酒精中脫水后，用CTAB提取液消化至溶液澄清；

2）對步驟1）制備的樣品用CTAB法提取DNA。

優選的，對于上文技術方案中，所述的CTAB法提取DNA的步驟如下：

①樣品抽提：向樣品消化液中加入等體積飽和酚、再加入等體積氯仿-異戊醇溶液混勻，上下震蕩離心，吸取上清液，再加入氯仿-異戊醇溶液混勻，離心吸取上清液；

②沉淀：向步驟①上清液中加入2倍體積無水乙醇混勻，放入-20℃冰箱20min，離心棄上清液；

③洗滌：用70%的乙醇洗滌2次后晾干；

④溶解：晾干后加入50uL的1%TE溶解，加入RNA酶2uL，-20℃保存待用。

優選的，對于上文技術方案中，所述的觸手與CTAB法中所用的CTAB提取液的比例為0.01g:300ul，50～55℃消化0.7～1.0小時。

上述技術方案中使用的溶液配制方法如下：

CTAB提取液的配制：3mL濃度為2%的CTAB溶液、30uL濃度為20mg/mL的蛋白酶K。

2%的CTAB溶液配制：稱取1g?CTAB溶解于20mL重蒸餾水中，移取8mL1M?Tris-HCl（pH8.0）和10mL0.5M?EDTA（pH8.0）于溶液中，再稱取1gNaCl加入到溶液中，并向溶液中加入100uL0.5%β–巰基乙醇，加重蒸餾水，定容至50mL。

氯仿-異戊醇溶液的配制：向24mL氯仿中加入1mL異戊醇。

有益效果：

本發明的幼海蜇基因組DNA提取方法，只需少量幼海蜇觸手，取樣品方便、無需研磨和剪碎等繁瑣操作，耗時短，更適合大規模基因組DNA提取；海蜇再生能力強，取少量觸手對個體成活無影響，更利于選擇育種基礎群體家系選育、分子標記輔助育種等后續研究。

附圖說明

圖1為本發明提取DNA檢測電泳圖：圖中編號1-5為幼海蜇觸手提取的DNA；編號6-10為幼海蜇傘狀部提取的DNA。上樣量均為5uL，其中M為Marker（DL15000）購自于寶生物工程（大連）有限公司。

具體實施方式

以下實施例是對本發明的進一步說明，而不是對本發明的限制。

實施例1：

用本發明的方法提取幼海蜇基因組DNA

1）取新鮮幼海蜇觸手2根約0.01g，放入95%酒精中脫水并保存；

2）2根經過步驟1）脫水處理的觸手用蒸餾水沖洗，用濾紙吸干表面水分后，無需處理，直接放入1.5mL的離心管中，加入300uLCTAB提取液，放入55℃雜交爐中，消化1.0小時，直至溶液澄清；

3）向樣品消化液中加入300uL飽和酚、300uL氯仿和異戊醇（24:1）混勻，上下震蕩10min，離心12000rpm10min，吸取上清液500uL；

4）加入500uL氯仿和異戊醇（24:1）混勻，離心12000rpm10min，吸取上清液400uL；

5）加入無水乙醇800uL混勻，放入-20℃冰箱20min，離心12000rpm10min，棄上清液；