[發明專利]與艱難梭菌細胞毒素B相互作用的蛋白

有效

• 申請號: 201310752493.X
• 申請日: 2013-12-31
• 公開（公告）號: CN103665141A
• 公開（公告）日: 2014-03-26
• 發明（設計）人: 魏文勝;袁鵬飛
• 申請（專利權）人: 北京大學
• 主分類號: C07K14/47
• 分類號: C07K14/47;C12N15/85;C12N5/071;A61K38/17;A61P31/04;G01N33/68
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君

技術領域

本發明涉及蛋白質工程領域，具體地說，涉及一種與艱難梭菌細胞毒素B相互作用的蛋白。

背景技術

艱難梭菌（Clostridium?difficile）是一種厭氧的革蘭氏陽性菌，最早發現于1935年，直到1978年發現該菌與臨床長期使用某些抗生素（氨芐青霉素、頭孢霉素、紅霉素、氯林可霉素等）引起的偽膜性腸炎有關，從而逐漸受到重視。目前，科學界已經公認艱難梭菌感染是臨床上抗生素相關性腹瀉（antibiotic-associated?diarrhoea，AAD）以及假膜性腸炎（pseudomenbranous?colitis，PMC）的主要病因。在2013年美國疾病預防與控制中心發布的文件中（ANTIBIOTIC?RESISTANCE?THREATS?in?the?United?States,2013）指出，僅在美國一地，每年有超過25萬人被艱難梭菌感染，其中14000人因此死亡。每年因治療艱難梭菌感染所需花費超過10億美元。

艱難梭菌通過分泌兩種外毒素，腸毒素A和細胞毒素B來實現其致病性。其中，毒素B被認為是艱難梭菌感染過程中所必須的外毒素（Lyras,2009）。毒素B通過受體介導的內吞機制進入細胞（Florin,1983），進一步通過糖基轉移酶活性使細胞內的GTPase失去活性，從而使腸細胞失去細胞骨架，細胞形態發生變化，腸細胞功能出現異常，引發強烈的腹瀉。

由于艱難梭菌具有很強的耐藥性，目前尚無一種非常有效的方法治療艱難梭菌感染（Rupnik,2009）。目前，對于艱難梭菌感染的細胞機制所知甚少，特別是毒素蛋白入胞機制，所應用的宿主受體蛋白尚不清楚。

發明內容

本發明的目的是提供一種與艱難梭菌細胞毒素B相互作用的蛋白。

為了實現本發明目的，本發明的一種與艱難梭菌細胞毒素B相互作用的蛋白，其為硫酸軟骨素蛋白多糖CSPG4，其氨基酸序列如SEQID?No.1所示，或該序列經替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

本發明的另一種與艱難梭菌細胞毒素B相互作用的多肽CSPG4N1-640，其由CSPG4蛋白N端640個氨基酸組成，其氨基酸序列如SEQ?ID?No.2所示，或該序列經替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

本發明還提供一種抗艱難梭菌感染的藥物，其有效成分為CSPG4或CSPG4N1-640。

本發明還提供一種用于診斷艱難梭菌感染的試劑，所述試劑中含有CSPG4或CSPG4N1-640。

本發明還提供一種用于診斷艱難梭菌感染的試劑盒，所述試劑盒中包括上述試劑。

本發明還提供CSPG4蛋白在制備抗艱難梭菌感染藥物及診斷試劑中的應用。

本發明還提供多肽CSPG4N1-640在制備抗艱難梭菌感染藥物及診斷試劑中的應用。

本發明還提供CSPG4基因打靶載體，其構建方法包括以下步驟：

1）基于TALEN基因敲除技術，采用ULtiMATE方法(Yang,2013)組裝針對CSPG4編碼序列5'-TCCAGCCCCCGGCCT-3'以及5'-CTGGCCAACATAGTC-3'的DNA識別區段，并最終克隆至pGL3-TALEN載體中；

2）基于CRISPR系統的基因敲除載體，以CSPG4編碼序列5'-TTGGCCAGACTTGCATCCG-3'為靶序列，通過酶切，將U6啟動子、靶序列和gRNA5'-GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT-3'依次連接，并克隆至pGL3-basic載體中，即得CSPG4基因打靶載體。

本發明還提供含有上述打靶載體的宿主細胞，其為人或哺乳動物細胞。

本發明首次發現CSPG4是艱難梭菌細胞毒素B的細胞受體。對CSPG4表達抑制可以顯著降低毒素B對細胞的毒性。考慮到毒素B在艱難梭菌感染中的不可或缺的作用，CSPG4將是治療艱難梭菌感染的重要靶點。