[發(fā)明專利]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建真核基因敲除文庫的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310751755.0
• 申請日: 2013-12-31
• 公開（公告）號: CN103668472A
• 公開（公告）日: 2014-03-26
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 魏文勝;周悅欣;朱詩優(yōu);蔡昌祖
• 申請（專利權(quán)）人: 北京大學(xué)
• 主分類號: C40B50/06
• 分類號: C40B50/06;C40B40/06;C12Q1/68
• 代理公司: 北京路浩知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因體學(xué)及基因工程領(lǐng)域，具體地說，涉及一種利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建真核基因敲除文庫的方法。

背景技術(shù)

基因敲除，即針對某個特定的基因，通過破壞或改變其基因序列令其功能喪失的一種技術(shù)手段。常用的基因敲除方法包括：鋅指核酸酶（ZFNs）(Miller?et?al.,2007;Porteus?and?Baltimore,2003;Wood?et?al.,2011)、類轉(zhuǎn)錄因子活化因子核酸酶（TALEN）(Miller?et?al.,2011;Wood?et?al.,2011;Zhang?et?al.,2011)，以及最近發(fā)現(xiàn)的原核生物第二類適應(yīng)性免疫系統(tǒng)CRISPER/Cas9系統(tǒng)(Cong?et?al.,2013;Mali?et?al.,2013)等。CRISPER/Cas9系統(tǒng)原本被細(xì)菌免疫系統(tǒng)用來抵御外源病毒或質(zhì)粒。在第二類CRISPER系統(tǒng)中，Cas9核酸內(nèi)切酶在sgRNA的引導(dǎo)下切割雙鏈DNA，造成基因組雙鏈斷裂，利用細(xì)胞基因組修復(fù)的不穩(wěn)定性產(chǎn)生修復(fù)錯誤（堿基的缺失或插入），從而可能造成基因功能的喪失，實現(xiàn)基因敲除的目的。

在基因敲除文庫產(chǎn)生之前，基于慢病毒載體的RNA干擾文庫成為研究基因功能的有效工具。由于其便利性，近年來shRNA文庫得以普遍應(yīng)用，利用這類shRNA干擾文庫尋找與某特定功能相關(guān)的基因，方法概括如下：使用慢病毒包裝系統(tǒng)包裝病毒；使用病毒感染靶細(xì)胞；利用抗生素或流式細(xì)胞儀富集病毒感染并整合的細(xì)胞，即為文庫細(xì)胞；篩選具有待研究功能相關(guān)性狀的細(xì)胞；提取篩選出的細(xì)胞和未作處理的文庫細(xì)胞的基因組DNA；通過PCR擴增shRNA整合的區(qū)段或擴增shRNA文庫設(shè)計時自帶的條碼（barcodes），利用深度測序技術(shù)進行測序；將測序結(jié)果與已知shRNA進行匹配；分析計算不同shRNA的富集程度，從而進一步研究被高度富集的shRNA所對應(yīng)基因的功能。

然而，shRNA文庫并不是基因敲除文庫，只能部分沉默基因表達(dá)。存在許多不足，例如對特定基因表達(dá)的影響往往不能導(dǎo)致表型的改變；可能錯誤地抑制不相關(guān)基因表達(dá)等。雖然有一些基因敲除文庫已被報道，特別是KBM7細(xì)胞，它是部分單倍體細(xì)胞，可用于構(gòu)建敲除文庫，但其穩(wěn)定性和效率都存在問題，而且該系統(tǒng)局限于特定細(xì)胞系，應(yīng)用范圍受限。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明旨在構(gòu)建真核基因敲除文庫，以及基于功能性篩選高效快速鑒定基因功能的方法學(xué)，并能夠達(dá)到大規(guī)模、高通量及覆蓋全基因組的目的。

為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明首先提供一種利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建真核基因敲除文庫的方法，包括以下步驟：

1）構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)OCT1蛋白和Cas9蛋白的真核細(xì)胞系：將編碼蛋白OCT1和Cas9的DNA序列通過柔性Linker連接，然后克隆至慢病毒載體pOCT1-2A-Cas9-IRES-BSD（SEQ?ID?No.1，圖8）上；用構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)染真核宿主細(xì)胞；篩選穩(wěn)定表達(dá)OCT1蛋白和Cas9蛋白的真核細(xì)胞系；

2）sgRNA質(zhì)粒文庫的構(gòu)建：

i.根據(jù)sgRNA作用位點的DNA序列5’-G-Nx-NGG-3’，其中19≤x≤22，設(shè)計并合成針對上述作用位點的sgRNA單體，針對同一個sgRNA作用位點設(shè)計兩個sgRNA單體，其序列分別為正向單體：5’-ACCG-Nx-3’，反向單體：5’-AAAC-N’x-3’，其中N’x為Nx的反向互補序列，N和N’表示堿基A、T、G或C；

ii.將上述合成的針對同一個sgRNA作用位點的兩個sgRNA單體退火形成具有粘性末端的雙鏈DNA，并將針對所有基因合成的sgRNA單體經(jīng)退火形成的雙鏈DNA等量混合；

iii.將人U6啟動子連接ccdB序列以及序列5’-G-Nx-NGG-3’之后，連入PLL3.7載體中替換原載體上的U6啟動子，將構(gòu)建好的載體與ii中得到的混合物混合，加入BsmBI限制性內(nèi)切酶和T4連接酶，37℃?5min，16℃?5min，重復(fù)10個循環(huán)；

iv.將上述產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞中，提取質(zhì)粒，即構(gòu)建得到sgRNA質(zhì)粒文庫；

3）將上述質(zhì)粒與質(zhì)粒psPAX2和PMD2.G共轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞中，培養(yǎng)細(xì)胞，收獲病毒液；