[發(fā)明專利]化學(xué)合成的HSV2病毒gE糖蛋白胞外區(qū)基因片段及其表達(dá)、應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310751325.9
• 申請(qǐng)日: 2013-12-31
• 公開（公告）號(hào): CN103740736A
• 公開（公告）日: 2014-04-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李越希;潘英;周潔;尚彥紅;徐悅玥;許桂麗;張素芬;馬穎;袁敬宇;李素芹;李丙軍;陳樂如;蔡冉
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 李越希
• 主分類號(hào): C12N15/38
• 分類號(hào): C12N15/38;C12N15/85;C07K14/035;A61K39/245;A61P31/22;G01N33/68;C12R1/93
• 代理公司: 南京君陶專利商標(biāo)代理有限公司 32215
• 代理人: 奚勝元

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及的是化學(xué)合成的HSV2病毒gE糖蛋白胞外區(qū)的全新基因片段，利用基因工程技術(shù)，制備重組HSV2病毒gE糖蛋白。通過計(jì)算機(jī)分析，篩選出含強(qiáng)抗原表位的HSV2病毒的gE糖蛋白胞外區(qū)片段，選擇真核和原核生物均偏愛的密碼子，化學(xué)合成全新的基因序列，利用基因工程技術(shù)表達(dá)，表達(dá)的蛋白可用于疫苗及HSV2病毒抗體或抗原的檢測(cè)等，本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)、疫苗和診斷試劑領(lǐng)域。

背景技術(shù)

單純皰疹病毒（Herpers?simplex?virus,?HSV）屬于皰疹病毒科α亞科，是人類感染的常見病毒之一，根據(jù)血清型可分為I和II型兩種。其中，I型主要通過口面部感染，也存在性傳播，II型主要通過性傳播，并且和女性宮頸癌的發(fā)生密切相關(guān)。近期越來越多的研究表明，HSV?I對(duì)阿茲海默癥的發(fā)生有關(guān)聯(lián)，HIV的感染和HSV?II也有聯(lián)系。HSV在全球普遍流行，HSV?I型在成人血清中陽(yáng)性率高達(dá)85%以上，HSV?II型全球血清陽(yáng)性率約為20%，并且發(fā)病人數(shù)以每年25%速度增加。

HSV可在感染組織或附近部位繁殖形成原發(fā)病灶，并在三叉神經(jīng)核脊神經(jīng)建立終身的潛伏感染，當(dāng)機(jī)體受到外界刺激或免疫力下降是，HSV病毒下行至表皮大量增殖，形成復(fù)發(fā)感染。HSV反復(fù)發(fā)作與HSV免疫逃逸相關(guān)，HSV通過躲避人體免疫系統(tǒng)的攻擊實(shí)現(xiàn)潛伏感染和復(fù)發(fā)感染，因此HSV一旦感染，很難被清除，患者受到長(zhǎng)期疾病折磨。

病毒糖蛋白?(glycoproteins,?gp)?是病毒毒粒表面的抗原決定簇，目前已發(fā)現(xiàn)并正式命名的包膜糖蛋白共有12個(gè)(gB、gC、gD、gE、gG、gH、gI、gK、gL和gM等)。gB和gD糖蛋白參與病毒與宿主細(xì)胞的吸附和融合，已被選作候選疫苗，對(duì)其研究較多。近年研究發(fā)現(xiàn)，gE2是免疫逃逸相關(guān)的包膜糖蛋白。HSV病毒包膜蛋白gE與IgG?Fc端結(jié)合，從而阻斷多個(gè)補(bǔ)體介導(dǎo)的免疫途徑，使HSV病毒成功躲避機(jī)體的免疫系統(tǒng)攻擊。因此他是造成病毒潛伏感染的蛋白分子之一。選取gE糖蛋白用于免疫機(jī)體，阻斷病毒的潛伏感染，有希望成為理想的候選疫苗。

本發(fā)明通過計(jì)算機(jī)分析，篩選出含強(qiáng)抗原表位的HSV2病毒的gE糖蛋白胞外區(qū)片段，選擇真核和原核生物均偏愛的密碼子，化學(xué)合成全新的基因序列，利用基因工程技術(shù)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物具有較好的抗原性和特異性，表達(dá)的蛋白可用于疫苗及HSV2病毒抗體或抗原的檢測(cè)等。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明是化學(xué)合成的HSV2病毒gE糖蛋白胞外區(qū)的全新基因片段，利用基因工程技術(shù)，制備重組HSV2病毒gE糖蛋白胞外區(qū)片段。通過計(jì)算機(jī)分析，篩選出含強(qiáng)抗原表位的HSV2病毒gE糖蛋白胞外區(qū)片段,第21個(gè)氨基酸?—?第414個(gè)?氨基酸，共394個(gè)氨基酸，選擇真核和原核生物均偏愛的密碼子，化學(xué)合成全新的基因序列，利用基因工程技術(shù)表達(dá)該基因。表達(dá)的蛋白可用于疫苗、HSV2病毒抗體或抗原的檢測(cè)及用于免疫制備抗HSV2病毒單抗和多抗等。

本發(fā)明通過計(jì)算機(jī)分析，篩選出含強(qiáng)抗原表位的HSV2病毒的gE糖蛋白胞外區(qū)片段，選擇真核和原核生物均偏愛的密碼子，化學(xué)合成全新的基因序列，利用基因工程技術(shù)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物具有較好的抗原性和特異性，表達(dá)的蛋白可用于疫苗及HSV2病毒抗體或抗原的檢測(cè)等。

化學(xué)合成的HSV2病毒gE糖蛋白胞外區(qū)基因片段及其表達(dá)、應(yīng)用是采取以下步驟實(shí)現(xiàn)的：

1．HSV2病毒gE糖蛋白胞外區(qū)抗原表位的篩選及其基因片段的化學(xué)合成：

利用ANTHEWIN等軟件，通過計(jì)算機(jī)分析HSV2病毒gE糖蛋白的氨基酸序列，?發(fā)現(xiàn)gE糖蛋白的N端（第21氨基酸?—?第414?氨基酸）含有較強(qiáng)的抗原決定簇。選擇真核和原核生物均偏愛的密碼子，化學(xué)合成全新的基因序列，并且在5'端增加了EcoRI酶切位點(diǎn)(下劃線部分)、起始密碼子（ATG）、信號(hào)肽（GGCTGGAGCTGTATTATCCTGTTCCTGGTCGCCACTGCCACTGGAGTTCATTCTGCC），在3'端增加了His標(biāo)記（CAC?CAC?CAC?CAC?CAC?CAC）、終止密碼子（TGA）和Himd?III酶切位點(diǎn)(下劃線部分)，使該基因片段易于克隆至質(zhì)粒pMCE5內(nèi)的EcoRI和Himd?III酶切位點(diǎn)內(nèi)。

篩選的HSV2病毒gE糖蛋白內(nèi)的抗原表位氨基酸序列（第21個(gè)aa?－?第414個(gè)aa）：