[發(fā)明專利]一種蔥蓮胚性細(xì)胞懸浮培養(yǎng)系的建立和植株再生的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310747637.2
• 申請日: 2013-12-31
• 公開（公告）號: CN103875528A
• 公開（公告）日: 2014-06-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 于波;朱根發(fā);孫映波
• 申請（專利權(quán)）人: 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境園藝研究所
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 廣州粵高專利商標(biāo)代理有限公司 44102
• 代理人: 倪小敏

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及植物誘導(dǎo)再生技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種蔥蓮胚性細(xì)胞懸浮培養(yǎng)系的建立和植株再生的方法。

背景技術(shù)

蔥蓮（Zephyranthes?candida?Herb.）又名蔥蘭、玉簾、白花菖蒲蓮，為石蒜科蔥蓮屬重要多年生的球根花卉，亦可藥用，原產(chǎn)美洲。蔥蓮具有耐貧瘠、易成活，花朵繁多，花期長，被廣泛用于城市園林綠化中，如花壇、花境、路邊或林下、坡地等處作為地被植物。

蔥蓮屬植物的組織培養(yǎng)研究始于20世紀(jì)70年代，F(xiàn)urmanova和Oledzka（1976；1981）較早地報(bào)道了由蔥蓮屬Z.robusta的離體鱗片誘導(dǎo)獲得再生小植株。陳揚(yáng)春（1992）以Z.candida的帶鱗莖盤的鱗片誘導(dǎo)獲得小鱗莖。Intakarn等（1997）使用Z.rosea的鱗莖基盤誘導(dǎo)出不定芽。?Gayathri和Gopal（2007）誘導(dǎo)蔥蓮屬植物的鱗莖基盤獲得不定芽。?Gangopadhyay等（2010）利用Z.grandiflora的鱗莖基盤誘導(dǎo)出不定芽并獲得完整植株，同時(shí)他們還利用鱗莖開展了Z.grandiflora的人工種子研制。鄧祖麗穎和袁秀云（2013）利用Z.candida頂芽作為外植體誘導(dǎo)獲得了愈傷組織并成功再生出植株。

何龍飛等（1995）以Z.candida的種子、根和幼花為外植體進(jìn)行培養(yǎng)，獲得了胚性愈傷并再生獲得植株。?這是首次在蔥蓮屬植物上通過體細(xì)胞胚發(fā)生途徑再生植株的報(bào)道。

一般認(rèn)為，植物胚性細(xì)胞懸浮培養(yǎng)系具有生長速度快、植株再生頻率高、轉(zhuǎn)化效率高等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為植物基因工程的良好受體材料（Liu?et?al.?2001;?Yu?et?al.?2007）。一些植物如柑橘（Dutt?and?Grosser,?2010）、葡萄(Wang?et?al.?2005)、水稻(Ozawa?and?Takaiwa,?2010)、檀香?(Shekhawat?et?al.?2008)、甜菜(Ivic?and?Smigocki,?2003)、香蕉?(Ghosh?et?al.?2009;?Chong-Pérez?et?al.?2012)、棉花(Rajasekaran?et?al.?2000)、美洲栗(Andrade?et?al.?2009)、六出花(Hoshino?et?al.?2008)等，已經(jīng)成功建立胚性細(xì)胞懸浮培養(yǎng)系并用于轉(zhuǎn)基因研究。

目前，還未見蔥蓮屬植物上建立胚性細(xì)胞懸浮培養(yǎng)系并再生植株的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是為了克服蔥蓮屬植物胚性細(xì)胞懸浮培養(yǎng)系的技術(shù)空白，提供一種蔥蓮胚性細(xì)胞懸浮培養(yǎng)系的建立和植株再生的方法

本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)：

????一種蔥蓮胚性細(xì)胞懸浮培養(yǎng)系的建立和植株再生的方法，包括如下步驟：

（a）誘導(dǎo)形成胚性愈傷組織；???

（b）建立胚性細(xì)胞懸浮培養(yǎng)系，獲得直徑大于0.7毫米的胚性細(xì)胞團(tuán)；

（c）利用步驟（b）獲得的胚性細(xì)胞團(tuán)再生植株，其中所述建立胚性細(xì)胞懸浮培養(yǎng)系包括如下步驟：

（b1）破碎所述胚性愈傷組織獲得直徑不超過0.7毫米的胚性細(xì)胞團(tuán)；

（b2）將0.2~1.0克的胚性細(xì)胞團(tuán)接種于20mL懸浮培養(yǎng)基中，在溫度25~27℃，光照800~1000?lux，90~110轉(zhuǎn)/分鐘震蕩培養(yǎng)，其中所述懸浮培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，每1升基本培養(yǎng)基中添加0.5~1.0毫克的噻苯隆、1.0~3.0毫克的2,4-D、20~40克的蔗糖，pH值為5.6~6.0；

（b3）6~8天繼代一次，繼代時(shí)將增殖的胚性細(xì)胞團(tuán)破碎，將0.1~0.2克的胚性細(xì)胞團(tuán)轉(zhuǎn)移至新鮮的懸浮培養(yǎng)基的中，按相同條件繼續(xù)培養(yǎng)，3~4周后，獲得大量胚性細(xì)胞團(tuán)。

????作為優(yōu)選實(shí)施方案，步驟（b2）中所述每1升基本培養(yǎng)基中添加1.0毫克的噻苯隆、1.0毫克的2,4-D、20~40克的蔗糖，pH值為5.6~6.0。

????作為優(yōu)選實(shí)施方案，步驟（b2）中所述胚性細(xì)胞團(tuán)的接種量為0.2g/20mL。

所述步驟（a）包括：

（a1）取蔥蓮的幼嫩花梗，經(jīng)表面消毒處理，將幼嫩花梗切成1~3厘米長的片段，接種于胚性誘導(dǎo)培養(yǎng)基中；

（a2）在溫度25~27℃的黑暗環(huán)境中培養(yǎng)12~16周，獲得亮黃色的松散易碎的胚性愈傷組織。