[發明專利]一種A型口蹄疫CTL表位肽及篩選方法

有效

• 申請號: 201310746389.X
• 申請日: 2013-12-30
• 公開（公告）號: CN103724405A
• 公開（公告）日: 2014-04-16
• 發明（設計）人: 高鳳山
• 申請（專利權）人: 大連大學
• 主分類號: C07K14/09
• 分類號: C07K14/09;A61K39/135;A61P31/14
• 代理公司: 大連八方知識產權代理有限公司 21226
• 代理人: 任洪成

技術領域

????本發明屬于分子免疫學領域，具體涉及SLA-Ⅰ結合并能夠引起細胞毒性免疫應答的A型口蹄疫CTL表位肽以及利用SLA-I復合體篩選和鑒定所述CTL表位肽的方法。

背景技術

豬主要組織相容性復合體(major?histocompatibility?complex,?MHC)，亦即豬的白細胞抗原(swine?leukocyte?antigen,?SLA)，是豬重要的免疫應答分子。SLA共分為三類，分別為SLA-I、SLA-II、SLA-III。其中SLA-I類分子包括重鏈和輕鏈，重鏈具有多態性，功能基因主要為SLA-1,?-2,?-3。而輕鏈由Beta?2微球蛋白(Beta?2?microglobulin,?β2m)基因編碼。在細胞內質網，SLA-I重鏈、抗原多肽與輕鏈以非共價鍵結合，形成SLA-I-peptides復合物，經高爾基體加工后，遞呈到細胞表面，與CD8+?T淋巴細胞受體結合，引起細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic?T?lymphocyte,?CTL)免疫應答，CTL釋放細胞因子并殺死被病毒感染的靶細胞。能夠與SLA-I類分子結合并能引起細胞毒性免疫應答的多肽即為CTL表位。

口蹄疫病毒(foot-and-mouth?disease?virus,?FMDV)是危害偶蹄類動物的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病的病原，血清型分為O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3和Asia1型，各型之間無交互免疫力。由于口蹄疫病毒的流行株不斷變異，傳統的疫苗已經不能適應口蹄疫防治的要求。含有多種血清型和不同流行株的表位疫苗可以起到防治不同血清型口蹄疫病毒的要求。研制口蹄疫病毒表位疫苗的關鍵是確定表位，細胞表位包括B細胞表位、輔助性T細胞(T?helper,?Th)表位和CTL表位。目前，多個B細胞表位和Th表位已經報道。口蹄疫屬于嚴格的細胞內寄生物，體液免疫固然重要，但細胞免疫必不可少。近來的研究表明，在FMDV急性發作期的控制主要是由中和抗體發揮作用，而在FMDV持續性感染期的免疫方面則主要由CTL?發揮作用。最近，一些學者開始研究口蹄疫病毒的CTL表位。2006年，Barfoed（Antiviral?Res,?2006,?72(3):178-89）等證實了一個小鼠H-2Kd限制性的來源于口蹄疫病毒非結構蛋白2C的CTL表位?KYKEAKEWL，能夠在小鼠體內引起CTL反應。另外，Guzman等（J?Gen?Virol,?2008,?89(Pt?3):667-75）最近也證實了一個牛BoLA?N*02201限制性的口蹄疫病毒CTL表位，該表位位于O型口蹄疫UKG/2001株結構蛋白的795-?803?氨基酸殘基，該表位能夠引起靶細胞殺傷效應。然而，到目前為止，所有報道的口蹄疫病毒CTL表位都是通過小鼠、牛等動物加以驗證，至今還未報道經豬SLA-I類分子直接遞呈的口蹄疫病毒CTL表位。

研究表明，利用體外構建MHC?I重鏈分子、肽及輕鏈復合體的方法可以在體外篩選病毒表位。White等（J?Immunol,?1999,?162(5):2671-6）用一個Linker將小鼠MHC-I的重鏈和輕鏈連接，構建了MHC-I分子，并證明了它可以和抗原肽分子特異結合。Denberg等（Eur?J?Immunol,?2000,?30(12):3522-32）用一個多肽、Linker、重鏈及輕鏈β2m構建了人的HLA-A2單鏈分子，并證明構建的結合多肽的單鏈分子具有識別細胞受體的功能。在課題組前期研究中，已經構建了六品系豬SLA-I復合體蛋白，并且在pMAL-p2X進行了表達，經檢測表達蛋白為可溶性蛋白，并保持良好的蛋白構象。本發明在前期研究的基礎上，利用構建的六品系豬SLA-I單鏈分子在體外結合口蹄疫病毒的CTL模擬表位肽，質譜測定篩選能夠與復合體結合的多肽。可結合的多肽經過ELISPOT實驗檢測多肽的CTL活性。本發明為今后大量篩選口蹄疫病毒CTL表位提供了方法，并為研制豬口蹄疫病毒多表位疫苗奠定基礎。

發明內容

本發明的目的在于提供一種能夠與SLA-??分子結合并能夠引起細胞毒性免疫應答的A型口蹄疫CTL表位肽。

為了實現上述目的，本發明所采用的技術方案為一種A型口蹄疫CTL表位肽，所述A型口蹄疫CTL表位肽命名為QA4，其由九個氨基酸殘基組成，其氨基酸序列為：Ala-Met-Leu-Arg-Ala-Ala-Thr-?Tyr-Tyr（SEQ?ID?No:1），即丙氨酸-甲硫氨酸-亮氨酸-精氨酸-丙氨酸-丙氨酸-蘇氨酸-酪氨酸-酪氨酸。