[發明專利]一種利用間接免疫熒光檢測豬瘟活疫苗病毒含量的方法

無效

• 申請號: 201310746312.2
• 申請日: 2013-12-30
• 公開（公告）號: CN103698518A
• 公開（公告）日: 2014-04-02
• 發明（設計）人: 楊靈芝;郭顯坡;王朝偉;張靜;程小囯
• 申請（專利權）人: 山東濱州博萊威生物技術有限公司
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N21/64
• 代理公司: 濟南舜源專利事務所有限公司 37205
• 代理人: 宋玉霞

技術領域

本發明屬于生物檢疫的技術領域，具體的涉及一種利用間接免疫熒光檢測豬瘟活疫苗病毒含量的方法。

背景技術

豬瘟（Classical?swine?fever，CSF或hog?cholera），又稱經典豬瘟或古典豬瘟，是感染豬的一種高傳染性疾病。豬瘟會導致患病豬發燒、厭食、腹瀉、死亡等，并可能帶有神經癥狀。母豬可能會流產或產下死豬崽。豬瘟為世界動物衛生組織所列的A類16種法定傳染病之一，中國則定為一類烈性傳染病。許多國家和地區使用豬瘟活疫苗強制接種免疫，也是目前防治豬瘟的最佳方法。

目前，我國生產豬瘟活疫苗病毒含量的檢測方法都是采用兔體反應熱法，該法存在費時費力，操作復雜，成本較高，重復性差等缺點。

發明內容

本發明的目的在于針對上述存在的缺陷而提供一種利用間接免疫熒光檢測豬瘟活疫苗病毒含量的方法，該方法通過用間接免疫熒光檢測活疫苗在傳代細胞中病毒，以達到快速準確、簡單有效的檢測出豬瘟活活疫苗病毒含量的目的。

本發明的技術方案為：一種利用間接免疫熒光檢測豬瘟活疫苗病毒含量的方法，包括如下步驟：

(1)準備傳代細胞

將長滿單層的細胞，用EDTA一胰酶消化分散，利用血清濃度為0.5%的細胞培養液終止消化，按照1:1傳代比例獲得傳代細胞懸液，將細胞懸液鋪96孔細胞培養板，每孔50uL；

(2)測定豬瘟活疫苗在傳代細胞中的病毒含量

取4℃預冷細胞基礎培養液，在冰盒上將豬瘟活疫苗進行10倍的倍比稀釋，將不同稀釋度的病毒懸液加入到（1）中96孔細胞培養板上的細胞懸液中，置于37℃溫箱中吸附，2h后取出，每孔補加含1.5～2倍血清濃度的細胞培養液，每孔100uL，將培養板重新置于培養箱中培養72h，同時設立不接毒正常細胞對照；

(3)熒光染色接毒細胞

①將細胞培養板從培養箱中取出，棄去培養板孔內液體，用PBS洗滌2～3次，每次2～3min，并輕輕甩干；

②加入-20℃下預冷的甲醇，在4℃條件下固定20～30min；

③棄去甲醇，室溫下自然揮干5min，PBS洗滌2～3次，每次2～3min，并輕輕甩干；

④加入PBS稀釋的豬瘟陽性血清一抗，在37℃條件下吸附50min；

⑤棄去豬瘟陽性血清一抗，PBS洗滌2～3次，每次2～3min，并輕輕甩干；

⑥加入PBS稀釋的兔抗豬熒光二抗，在37℃下吸附40min；

⑦棄去兔抗豬熒光二抗，PBS洗滌2～3次，每次2～3min；

⑧置于熒光顯微鏡下觀察熒光情況，判定豬瘟活疫苗感染滴度。

所述步驟(2)中豬瘟活疫苗稀釋在0～4℃低溫環境下進行。

所述步驟(2)中病毒接細胞后72h進行間接免疫熒光檢測。

所述步驟(3)中豬瘟陽性血清一抗的稀釋倍數為40倍，兔抗豬熒光二抗的稀釋倍數為32倍。

所述步驟(1)中預冷細胞基礎培養液為MEM培養基。

本發明的有益效果為：本發明所述利用間接免疫熒光檢測豬瘟活疫苗病毒含量的方法，通過用間接免疫熒光檢測活疫苗在傳代細胞中病毒，所選用的條件參數使得檢測結果更加準確，具有以下特點：

（1）檢測時間短，只需要1天，而通常用兔體感染劑量檢測至少需要11天。

（2）用細胞感染病毒，操作相對簡單，成本低，不需要買大量的實驗動物，同時不需要專人測定實驗動物體溫。

（3）利用細胞感染病毒，條件均一、穩定，不會出現實驗動物個體差異而引起的實驗結果差異顯著。

具體實施方式

下面通過具體實施例對本發明進行詳細的說明。

一種利用間接免疫熒光檢測豬瘟活疫苗病毒含量的方法，包括如下步驟：

(1)準備傳代細胞

將長滿單層的細胞，用EDTA一胰酶消化分散，利用血清濃度為0.5%的細胞培養液終止消化，按照1:1傳代比例獲得傳代細胞懸液，將細胞懸液鋪96孔細胞培養板，每孔50uL；

(2)測定豬瘟活疫苗在傳代細胞中的病毒含量