[發(fā)明專(zhuān)利]一種提高厭氧發(fā)酵目標(biāo)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率的方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310745214.7
• 申請(qǐng)日: 2013-12-30
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103710396A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-04-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 蔡恒;周志惠;汪晨
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 南京工業(yè)大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12P7/46
• 分類(lèi)號(hào): C12P7/46;C12P7/40;C12P7/56;C12P7/52;C12P19/02;C12P7/18;C12P3/00;C12R1/15;C12R1/19;C12R1/22;C12R1/145;C12R1/46
• 代理公司: 南京蘇高專(zhuān)利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙) 32204
• 代理人: 肖明芳

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體是微生物厭氧發(fā)酵法生產(chǎn)目的物質(zhì)。

背景技術(shù)

有機(jī)酸和醇類(lèi)的發(fā)酵是傳統(tǒng)工業(yè)生產(chǎn)的典型例證，被廣泛應(yīng)用于食品，藥品，染料等眾多工業(yè)領(lǐng)域，但其真正的潛力是作為大規(guī)模工業(yè)原料的應(yīng)用。社會(huì)對(duì)有機(jī)酸和醇類(lèi)的需求正逐年增加，但是傳統(tǒng)的以石油產(chǎn)品作為原料生產(chǎn)有機(jī)酸和醇類(lèi)的方法具有污染重，成本高等缺點(diǎn)，同時(shí)也不符合國(guó)家提出的構(gòu)建和諧社會(huì)的理念。為了能經(jīng)濟(jì)、環(huán)保、可持續(xù)發(fā)展，有機(jī)酸和醇類(lèi)的生產(chǎn)方式得到很大的改善。目前，利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)目的產(chǎn)物的策略深入人心。

產(chǎn)有機(jī)酸和醇類(lèi)的工業(yè)微生物菌種很多，具有代表性的是大腸桿菌（Escherichia?coli），產(chǎn)丁二酸放線菌（Actinobacillus?succinogenes），谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium?glutamicum），釀酒酵母，烷嗜熱厭氧桿菌等。隨著生物技術(shù)、基因工程技術(shù)、代謝工程技術(shù)的迅猛發(fā)展，采用分子生物學(xué)手段，加強(qiáng)微生物代謝有機(jī)酸和醇類(lèi)途徑中的基因的表達(dá)，削弱副產(chǎn)物代謝途徑，從而增加目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量。從發(fā)酵調(diào)控角度，可以通過(guò)優(yōu)化發(fā)酵條件，使微生物獲得最優(yōu)的生產(chǎn)環(huán)境。除了丁二酸、乳酸、乙醇等一些大眾化學(xué)品之外，微生物生產(chǎn)的物質(zhì)種類(lèi)很多，例如一些抗生素和維生素等，這些物質(zhì)在代謝途徑中可以作為合成目標(biāo)代謝物質(zhì)的前體，參與代謝流。

在利用上述各種工業(yè)微生物生產(chǎn)有機(jī)酸和醇類(lèi)時(shí)，每種物質(zhì)都是由細(xì)胞內(nèi)代謝途徑合成的。例如在谷氨酸棒桿菌厭氧代謝產(chǎn)目的物質(zhì)有機(jī)酸和醇類(lèi)時(shí)，參與代謝流的有糖，碳酸鹽等，但其中重要的是一種輔酶—NADH，即還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸。NADH對(duì)微生物代謝反應(yīng)中相應(yīng)酶作用是必須的，例如在谷氨酸棒桿菌代謝生產(chǎn)丁二酸的代謝途徑中，生成1mol的丁二酸需要消耗2mol的NADH。

微生物生產(chǎn)目的產(chǎn)物過(guò)程中，存在NADPH過(guò)剩的問(wèn)題，這樣在一定程度上不利于目的產(chǎn)物的積累。大腸桿菌報(bào)道中，其中與NADH產(chǎn)生有關(guān)的酶之一是轉(zhuǎn)氫酶（Transhydr?ogenase），轉(zhuǎn)氫酶是直接催化輔酶NDAH和NADPH互相轉(zhuǎn)換的酶，能夠調(diào)節(jié)輔酶水平。Anderlund等人將大腸桿菌中的轉(zhuǎn)氫酶基因?qū)氩缓修D(zhuǎn)氫酶基因的釀酒酵母中，但是反應(yīng)中氫離子的轉(zhuǎn)移方向與大腸桿菌中不同，是從NADPH轉(zhuǎn)移到NAD⁺。Nissen等將來(lái)源于Azotobacter?vinelandii的可溶性轉(zhuǎn)氫酶轉(zhuǎn)入釀酒酵母，由于缺乏NADPH產(chǎn)生大量α—酮戊二酸。然而在重組釀酒酵母木糖代謝過(guò)程中，由于XR和XDH的作用，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)中NADH和NADP⁺，需再生NADPH和NAD⁺，才能保證代謝順利進(jìn)行，但是引入外源轉(zhuǎn)氫酶后，輔酶產(chǎn)生方向與所需方向相反，所以未能起到提高重組酵母利用木糖生產(chǎn)酒精的能力。上述現(xiàn)有的技術(shù)表明NADH作為反應(yīng)主要的還原力，當(dāng)NADPH不足時(shí)，并不會(huì)使輔酶產(chǎn)生的方向與所需方向一致，這樣的報(bào)道給本發(fā)明提供進(jìn)一步依據(jù)，當(dāng)胞內(nèi)NADPH過(guò)剩時(shí)，異源表達(dá)轉(zhuǎn)氫酶基因，能夠使輔酶產(chǎn)生方向與所需方向一致，提供足夠的NADH用于生產(chǎn)目的物質(zhì)，同時(shí)減少用于合成所需的NADH而消耗的葡萄糖，從而提高目的產(chǎn)物的產(chǎn)率。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的所要解決的技術(shù)問(wèn)題是解決微生物厭氧發(fā)酵生產(chǎn)體系內(nèi)輔酶不平衡，導(dǎo)致目的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率不高的問(wèn)題，從而提供一種提高厭氧發(fā)酵目標(biāo)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率的方法。

對(duì)于在微生物體內(nèi)進(jìn)行的丁二酸、木糖醇、乳酸等很多物質(zhì)的合成，需要很多還原反應(yīng)的參與。NADH作為這些物質(zhì)合成的主要還原力。例如，在丁二酸的合成途徑中，蘋(píng)果酸脫氫酶，富馬酸合成酶需要NADH作為輔酶；在乳酸的合成途徑中，乳酸脫氫酶需要NADH作為輔酶。因此，在微生物厭氧合成丁二酸、乳酸、乙酸等物質(zhì)時(shí)，NADH還原力的供給是必不可少的。

NADH在生物體內(nèi)的糖酵解、檸檬酸循環(huán)和光合作用等過(guò)程中，起著電子傳遞的重要作用。在生物合成反應(yīng)中，約80%的反應(yīng)需要腺嘌呤二核苷酸（NAD,NADH）作為輔酶，10%的反應(yīng)以腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP,NADPH）為輔酶。

在谷氨酸棒桿菌發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的過(guò)程中，產(chǎn)生不能被利用的成分NADPH，胞內(nèi)過(guò)剩的NADPH造成微生物生產(chǎn)體系內(nèi)輔酶不平衡，并且谷氨酸棒桿菌微生物內(nèi)本身不含有能實(shí)現(xiàn)NADPH高效轉(zhuǎn)化為NADH的功能基因，從而造成目的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率不高，副產(chǎn)物積累的問(wèn)題日趨顯現(xiàn)。