[發(fā)明專利]一種Ⅰ型、新型鴨肝炎二價卵黃抗體的制備方法及其產(chǎn)品和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310744694.5
• 申請日: 2013-12-30
• 公開（公告）號: CN103709247A
• 公開（公告）日: 2014-04-09
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 宋揚;王彬;柴華;藏玉婷;于洪濤;閆冰;王昊;陳海娟;田野;戴金玲
• 申請（專利權(quán)）人: 哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司
• 主分類號: C07K16/02
• 分類號: C07K16/02;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/30;C07K16/10;A61K39/42;A61P31/14
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11139
• 代理人: 孫皓晨

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種卵黃抗體的制備方法，特別涉及一種Ⅰ型、新型鴨肝炎二價卵黃抗體的制備方法及其產(chǎn)品和應(yīng)用。本發(fā)明屬于水禽用生物制品技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

鴨甲型肝炎（Duck?Hepatitis?A,DHA）是由鴨甲型肝炎病毒（Duck?Hepatitis?A?Virus,DHAV）引起雛鴨的一種以肝臟為主要病理變化的急性、高度致死性、接觸性傳染病。該病主要侵害1～3周齡的雛鴨，傳播迅速，發(fā)病嚴(yán)重，臨床癥狀主要表現(xiàn)為痙攣、抽搐和角弓反張，以肝臟腫脹和出血為主要病理變化。病鴨多在出現(xiàn)癥狀后的1小時內(nèi)死亡，10日齡雛鴨感染后死亡率可達(dá)90%以上，該病已經(jīng)成為嚴(yán)重危害養(yǎng)鴨業(yè)的主要疾病之一。

鴨肝炎病毒包含嗜肝病毒科、星狀病毒科和小核糖核酸病毒科3個病毒科的4種病毒。嗜肝病毒科的鴨肝炎病毒引起鴨乙型肝炎，其對鴨沒有顯著的致病性；星狀病毒科引起Ⅱ型鴨肝炎，目前為止僅英國有發(fā)病報道；目前我國流行的是由小核糖核酸病毒科引起的Ⅰ型和新型鴨甲型肝炎。對于血清I型病毒，我國已經(jīng)采用了多年的卵黃抗體進(jìn)行預(yù)防和治療，并取得了一定的效果，但今年來不斷從病鴨中同時分離到I型和新型鴨肝炎病毒，證明我國多地出現(xiàn)血清I型和新型鴨肝炎混合感染的情況。血清中和試驗表明，I型和新型之間缺乏交叉保護(hù)作用，I型卵黃抗體很難對流行的新型鴨肝炎病毒進(jìn)行預(yù)防，I型和新型二價卵黃抗體是預(yù)防和控制鴨病毒性肝炎的必然要求，因此探討I型、新型鴨肝炎二價卵黃抗體的提取方法對有效防治該病具有是十分重要的意義。

卵黃抗體（egg?yolk?antibodies，IgY）是指產(chǎn)蛋雞受特定抗原免疫后產(chǎn)生并轉(zhuǎn)移和貯存在卵黃中的特異性抗體，從蛋黃中將IgY提取并應(yīng)用在動物疾病的防治中已得到廣泛認(rèn)可。但I(xiàn)gY被廣泛應(yīng)用的前提是如何將卵黃中將大量的IgY提取、純化出來。近年來，國內(nèi)外學(xué)者報道了許多卵黃抗體的制備方法，但由于提取方法的不當(dāng)，缺少抗體純化過程，導(dǎo)致提取過程中，抗體大量損失，效價大幅降低，大量雜蛋白及脂肪等物質(zhì)未被除去，同時存在提取藥品的殘留。其結(jié)果是一方面，造成抗體提取成本的提高；其另一方面，造成抗體注射困難、難以吸收、注射局部腫脹、過敏反應(yīng)嚴(yán)重，直接導(dǎo)致抗體治療效果不佳，嚴(yán)重影響抗體的使用效果，極大的限制了卵黃抗體在疾病防治上的應(yīng)用。

目前常采用的方法包括酸化水法、聚乙二醇法、氯仿法以及辛酸法等，其中酸化水提取法除脂效果不佳，卵黃抗體中含有大量雜蛋白；聚乙二醇法中使用聚乙二醇易溶于水，目前尚沒有辦法去除，對畜禽有一定的危害，IgY含有一定雜蛋白，抗體純度不高；氯仿法中使用氯仿有殘留和毒性，對卵黃抗體的品質(zhì)有較大影響，易引起注射部位腫脹，及動物全身不良反應(yīng)；辛酸法中辛酸在水中溶解度極低（0.062g/L），因此在水溶性物質(zhì)中辛酸殘留量極微。在醫(yī)學(xué)工業(yè)中辛酸已被廣泛應(yīng)用，對生物不具毒副作用。但單純使用辛酸萃提，蛋白純度低，效價低，治療效果不明顯。

發(fā)明內(nèi)容

針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的種種技術(shù)缺陷，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題之一，是提供一種卵黃抗體的提取方法，以解決目前存在的由于提取方法的不當(dāng)，缺少抗體純化過程，導(dǎo)致提取過程中，抗體大量損失，效價大幅降低，大量雜蛋白及脂肪等物質(zhì)未被除去，同時存在提取藥品的殘留的問題。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)手段為：

本發(fā)明的一種卵黃抗體（egg?yolk?antibodies，IgY）的提取方法，其特征在于包括以下步驟：

（1）收集高免蛋；

（2）將高免蛋浸入新潔爾滅水溶液中消毒，然后用甲醛熏蒸高免蛋，打破蛋殼，除去蛋清、胚盤和系帶，收集卵黃；

（3）除脂

量取卵黃體積，加入滅菌玻璃瓶內(nèi)，按其體積的1.5-2.5倍加入海藻酸鈉溶液，混合并調(diào)至pH5.0-5.2，置2～8℃保存過夜；

其中，所述的海藻酸鈉溶液中，按重量百分比計，含有0.1-0.15％（w/w）的海藻酸鈉以及0.02-0.08％（w/w）的NaC1，其余為純化水；

（4）鹽析

次日，吸取上清液，調(diào)pH7.2，加入硫酸銨至終濃度為28%（w/w），再攪拌均勻，離心，棄掉上清，沉淀用PBS緩沖液溶解沉淀；

（5）抗體的純化

沉淀溶解液經(jīng)截留分子量為50KD的超濾膜包過濾濃縮至原體積1/5，加入PBS緩沖液恢復(fù)至原體積再進(jìn)行濃縮，反復(fù)3次，獲得卵黃抗體原液，置2～8℃保存；

（6）抗體的滅活除菌

獲得的卵黃抗體原液用滅菌生理鹽水稀釋后經(jīng)甲醛溶液滅活，然后經(jīng)濾膜過濾得到最終的卵黃抗體提取液。