[發明專利]CYP119酶表達載體及其純化方法

在審

• 申請號: 201310744163.6
• 申請日: 2013-12-30
• 公開（公告）號: CN104745615A
• 公開（公告）日: 2015-07-01
• 發明（設計）人: 王欽;張春;李靜;何芳;肖星茂
• 申請（專利權）人: 瀘州醫學院
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N1/21;C12N9/04;C12R1/19
• 代理公司: 成都虹橋專利事務所(普通合伙) 51124
• 代理人: 梁鑫

1.含有CYP119酶編碼基因的載體。

2.如權利要求1所述的載體，其特征在于：所述的CYP119酶的氨基酸序列為SEQ?ID?No.2或SEQ?ID?No.4所示。

3.如權利要求1或2所述的載體，其特征在于：所述的CYP119酶編碼基因的核苷酸序列為：SEQ?ID?No.1或SEQ?ID?No.3所示。

4.如權利要求1～3任一項所述的載體，其特征在于：所述的載體為表達載體。

5.如權利要求1～4任一項所述的載體，其特征在于：所述的載體為質粒。

6.如權利要求5所述的載體，其特征在于：所述的質粒為pET30a。

7.如權利要求6所述的載體，其特征在于：所述的pET30a的核苷酸序列如SEQ?ID?No.9所示。

8.含有權利要求1～7任一項所述載體的宿主。

9.如權利要求8所述的宿主，其特征在于：所述的宿主為大腸桿菌。

10.CYP119酶的純化方法，其特征在于：包括以下步驟：

a、取發酵后的菌液離心收集菌體，PBS懸浮菌體，破碎細胞，獲得粗酶液；

b、0.22μm過濾膜過濾粗酶液，4℃下利用Ni-NTA親和柱進行粗酶的純化；

c、對洗脫液進行超濾膜濃縮，5000g4℃，離心60min，利用無咪唑的PBS溶液置換2次，得到純品。

11.如權利要求10所述的方法，其特征在于：步驟b中的洗脫條件為：平衡液I洗脫5個柱體積；將0.22μm過濾膜過濾后的粗酶液上柱；平衡液I洗5個柱體積；平衡液II洗5個柱體積；洗脫液I洗6～10個柱體積；洗脫液II洗5個柱體積，收集洗脫液。

12.如權利要求11所述的方法，其特征在于：平衡液I為50mM?PBS，pH7.4，5mM咪唑；平衡液II為50mM?PBS，0.5M?NaCl，pH7.4，5mM咪唑；洗脫液I為50mM?PBS，pH7.4，20mM咪唑；洗脫液II為50mM?PBS，pH7.4，80mM咪唑。