[發明專利]一種快速構建高表達穩定性細胞株的方法

有效

• 申請號: 201310743883.0
• 申請日: 2013-12-30
• 公開（公告）號: CN103695375A
• 公開（公告）日: 2014-04-02
• 發明（設計）人: 陳倩怡;王笑非
• 申請（專利權）人: 佛山安普澤生物醫藥有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/63
• 代理公司: 廣州新諾專利商標事務所有限公司 44100
• 代理人: 李國釗;劉婉

1.一種快速構建高表達穩定性細胞株的方法，步驟如下：

（1）構建Gal4-VP16融合蛋白的表達載體質粒，在Gal4及VP16之間加入大T抗原核定位信號；

（2）構建UAS-目標基因蛋白的表達載體質粒，在該UAS-目標基因蛋白的表達載體質粒的啟動子前構建5個UAS?cis-調節位點；

（3）采用IRES連接目標基因及DHFR基因，將上述Gal4-VP16融合蛋白的表達載體質粒及UAS-啟動子-目標基因的表達載體質粒同時轉導入宿主細胞中；

（4）選擇篩選目標基因的穩定表達細胞株；

（5）擴增；

（6）獲得高表達穩定細胞株。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述宿主細胞為DHFR-CHO細胞。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述步驟（1）中所述Gal4-VP16融合蛋白的表達載體質粒上含有博來霉素的表達基因，所述步驟（2）中所述UAS-目標基因蛋白的表達載體質粒上含有新霉素的表達基因，所述步驟（4）中用含有新霉素、博來霉素和缺失GHT的培養基進行選擇篩選。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述步驟（5）中用甲氨蝶呤進行擴增。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述步驟（1）中以Clonetech-VP16質粒為模板，首先以P1和P2為引物，用pfu?DNA酶進行PCR反應，擴增出帶有大T抗原核定位信號的VP16啟動子激活位點的蛋白信號；將得到的PCR片段及含有Gal4DNA結合位點的質粒pBIND-Gal4分別用內切酶BamH1和XbaI處理，隨后將處理后的載體和PCR產物進行連接，構建成含有pBind-Gal4-VP16的表達載體質粒pBind-Gal4-VP16；隨后將得到的pBind-Gal4-VP16質粒及pCDNA3.1(+)/Zeo分別用內切酶NHeI和XbaI處理，把從pBind-Gal4-VP16質粒切下的750bp片段Gal4-VP16連接到pCDNA3.1(+)/Zeo質粒上，pCDNA3.1(+)/Zeo質粒上含有博來霉素的表達基因，從而構造成pCDNA3.1-Gal4-VP16-Zeo表達載體質粒。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（3）中，把要表達的目標基因克隆到PPS4-SI-UAS-KpnI質粒中：PPS4-目標基因質粒用BamHI及NHeI處理，分離出目標基因片段，PPS4-SI-UAS-KpnI質粒用BglII及NHeI處理，把上述目標基因片段的目標基因克隆到PPS4-SI-UAS-KpnI質粒中，形成最后的含有UAS及目標基因的表達載體。