[發明專利]TNFα與DC-SIGN的融合蛋白及其應用

有效

• 申請號: 201310743708.1
• 申請日: 2013-12-30
• 公開（公告）號: CN103739714A
• 公開（公告）日: 2014-04-23
• 發明（設計）人: 馬永;侯景;姚翔;羅成;徐春林;陳晨;王耀方
• 申請（專利權）人: 江蘇眾紅生物工程創藥研究院有限公司;常州京森生物醫藥研究所有限公司
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N15/85;C12N5/10;A61K38/19;A61K47/48;A61P35/00
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 傅婷婷;徐冬濤

技術領域

本發明涉及基因工程領域，涉及TNFα與DC-SIGN的融合蛋白及其應用，更具體而言，本發明涉及包含識別變異或高表達糖鏈的DC表面的特異性細胞間黏附因子3結合非整合素分子（DC-SIGN,dendritic-cell-specific?ICAM-3-grabbing?nonintegrin）的胞外區結構域、連接肽和腫瘤壞死因子（TNF）的融合蛋白。

背景技術

隨著人們生活環境及生活方式的改變，抗腫瘤市場正在逐步擴大，目前治療腫瘤的放療和化療等常規手段無法區分腫瘤細胞和正常組織細胞，常常導致嚴重的副作用，往往在殺傷腫瘤細胞的同時也破壞機體正常的免疫功能，使患者的生存、生活質量大大下降。因此減少現在的腫瘤治療藥物的毒副作用成為亟需解決的課題，目前研究已表明靶向性抗腫瘤藥物具有高效、低毒副作用和低成本腫瘤治療的特點，已成為近期研究的熱點。

根據識別位點的不同，靶向抗癌藥物主要包括單克隆抗體和小分子蛋白激酶抑制劑。單抗的作用機理是利用腫瘤細胞表面有一些特異的腫瘤抗原可作為攻擊靶點，而小分子蛋白激酶抑制劑能靶向抑制異常蛋白激酶受體，從而抑制腫瘤的生長、分化、代謝等生物學過程而起到抗腫瘤的療效。然而，單抗藥物和激酶抑制劑藥物對腫瘤細胞僅有單一的識別位點，對識別位點有突變或結構改變的癌癥細胞殺傷效果有限，因此臨床上多為聯合治療藥物，且其市場多被跨國公司所壟斷，價格非常昂貴。因此，開發靶向性和療效更好、價格更為低廉的靶向抗腫瘤藥物將大大提高惡性腫瘤患者的生產質量，降低患者的醫療開銷費用。

凝集素(lectin)是一類能選擇性地識別糖并與之非共價可逆結合的非酶、非抗體蛋白質。DC-SIGN/CD209（Dendritic?Cell-Specific?Intercellular?adhesion?molecule-3-Grabbing?Non-integrin）的結構中含有鈣依賴型的糖類識別區域（carbohydrate?recognition?domain，CRD），屬于C型凝集素的范疇。DC-SIGN可以廣泛結合病原體來源的糖類結構，如包含有甘露糖的糖結合物以及包含巖藻糖的路易斯血型抗原(Lew?blood?group?Ags)Le^x、Le^y、Le^a和Le^b（M.Nonaka?et?al.,J?Biol?Chem286,22403）。DC-SIGN還具有特異性識別和結合腫瘤細胞糖標志物的能力，這些腫瘤糖標志物包括CEA、Lewis血型抗原、Mac-2BP、Span-1等。這種結合通過C型凝集素的CRD區域和腫瘤特異性糖鏈（Man,D-GlcNAc,Fuc）相互識別來實現。

細胞凋亡(Apoptosis)是由基因控制的能量依賴性細胞有序的主動凋亡的過程。細胞凋亡因子與受體結合后可引起細胞凋亡途徑，有效抑制或殺傷細胞，亦可用于抗腫瘤新藥的研發。腫瘤壞死因子（TNF）作為迄今發現的抗腫瘤活性最強的細胞因子，早在上世紀80年代歐美曾對其展開臨床研究，但由于其生物效應廣泛、毒副作用較大而被迫終止。因此，如何在保證TNF治療效應的前提下降低其毒副作用成為腫瘤壞死因子家族成員能否作為抗腫瘤藥物的關鍵性問題。專利CN1458977A和CN1865444A曾采用單克隆抗體的單鏈作為靶向結構域與TNFα融合表達。這類融合蛋白的靶向功能依賴于單鏈抗體（scFv）的靶向性。但是，單鏈抗體結構復雜、結合能力差、表達不穩定，且識別位點單一，抗原位點如發生突變等即無法達到靶向的作用，從而影響到了單抗的整體功能。因此，開發一種具有腫瘤細胞高特異識別的、穩定的抗腫瘤藥物具有重要的意義。

發明內容

為克服上述不足，本發明第一個目的是提供一種靶向抗腫瘤融合蛋白，其由識別功能域和作用功能域，以及連接這兩個功能域的連接肽組成。所述識別功能域是C型凝集素，位于融合蛋白的C端；所述作用功能域是腫瘤壞死因子，位于融合蛋白的N端；所述連接肽為含有8-25個氨基酸的短肽。

優選的，上述所述的識別功能域是DC-SIGN/CD209。更優選的，上述所述的識別功能域是DC-SIGN/CD209的胞外區。

優選的，上述所述的作用功能域是TNFα。更優選的，上述所述的作用功能域是TNFα的胞外區。

優選的，上述所述的連接肽是柔性連接肽。

優選的，上述所述的連接肽的氨基酸序列為GGGGGGGGGG或(EAAAK)_n或(GGGGS)_n，其中n=3,4或5。