[發(fā)明專利]一種穩(wěn)定熒光標記口腔鱗癌活細胞的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310741811.2
• 申請日: 2013-12-27
• 公開（公告）號: CN103675262A
• 公開（公告）日: 2014-03-26
• 發(fā)明（設計）人: 步榮發(fā);黃雪蕾
• 申請（專利權）人: 步榮發(fā);黃雪蕾
• 主分類號: G01N33/533
• 分類號: G01N33/533
• 代理公司: 廈門市首創(chuàng)君合專利事務所有限公司 35204
• 代理人: 張松亭

技術領域

本發(fā)明屬于腫瘤分子影像技術領域，具體涉及一種穩(wěn)定熒光標記口腔鱗癌活細胞的方法。

背景技術

口腔鱗狀細胞癌(Oral?squmaous?cell?carcinoma，OSCC)簡稱口腔鱗癌，為主要發(fā)生于口腔粘膜上皮等部位的惡性腫瘤，是頭頸部常見的惡性腫瘤，約占口腔頜面部惡性腫瘤的90%-95%，常引起嚴重的口腔頜面畸形及咀嚼、吞咽和語言等功能障礙并威脅患者生命。口腔鱗癌的發(fā)病部位以舌部最多，其次以牙齦為多，此外，在頰粘膜、腭、口底等其它的口腔粘膜、以及頜骨、唾液腺上也有發(fā)生。

現(xiàn)有技術中對口腔鱗癌細胞的熒光標記主要是采用固定后的死細胞，雖然經固定的細胞形態(tài)完整，成像效果良好，但沒有辦法對口腔鱗癌細胞活細胞進行穩(wěn)定的標記，從而無法進行口腔鱗癌活細胞的觀察研究。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術缺陷，提供一種穩(wěn)定熒光標記口腔鱗癌活細胞的方法。

本發(fā)明的技術方案如下：

一種穩(wěn)定熒光標記口腔鱗癌活細胞的方法，用熒光偶聯(lián)的尼妥珠單克隆抗體對口腔鱗癌活細胞進行標記。

在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述熒光偶聯(lián)的尼妥珠單克隆抗體所用的熒光材料為近紅外熒光材料Alexa680。

進一步優(yōu)選的，包括如下步驟：

（1）將近紅外熒光材料Alexa680與尼妥珠單克隆抗體偶聯(lián)；

（2）將Alexa680偶聯(lián)的尼妥珠單克隆抗體與的口腔鱗癌活細胞進行避光孵育后洗滌；

（3）進行流式細胞儀檢測和共聚焦顯微鏡檢測。

進一步優(yōu)選的，所述流式細胞儀檢測的激發(fā)波長為633nm，發(fā)射濾片670LP。

進一步優(yōu)選的，所述共聚焦顯微鏡檢測的激發(fā)波長為633nm，發(fā)射濾片650LP。

在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述熒光偶聯(lián)的尼妥珠單克隆抗體所用的熒光材料為量子點Qdot800。

進一步優(yōu)選的，包括如下步驟：

（1）將量子點Qdot800與尼妥珠單克隆抗體偶聯(lián)；

（2）將Qdot800偶聯(lián)的尼妥珠單克隆抗體與口腔鱗癌活細胞進行避光孵育后洗滌；

（3）進行流式細胞儀檢測和共聚焦顯微鏡檢測。

進一步優(yōu)選的，所述流式細胞儀檢測的激發(fā)波長為407nm，發(fā)射濾片780/60nm。

進一步優(yōu)選的，所述共聚焦顯微鏡檢測的激發(fā)波長為488nm，發(fā)射濾片650LP。

本發(fā)明的有益效果是：

1、本發(fā)明的方法用熒光偶聯(lián)的尼妥珠單克隆抗體對口腔鱗癌活細胞進行穩(wěn)定標記，從而可以進行口腔鱗癌活細胞的觀察研究，豐富了研究人員的實驗手段，拓展了相應的研究領域；

2、本發(fā)明的采用近紅外熒光材料Alexa680和量子點Qdot800作為熒光標記材料與口腔鱗癌特異性單克隆抗體尼妥珠進行偶聯(lián)，熒光強度高、標記特異性強，成像穩(wěn)定且保存時間長；

3、本發(fā)明的方法操作簡便快速，且成本低廉。

4、尼妥珠單克隆抗體(Nimotuzumab，h-R₃，商品名泰欣生)是一種新的已臨床應用的人源化抗EGFR單克隆抗體分子靶向藥物，本方法可用于標記其它過表達EGFR的細胞。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例2的共聚焦顯微鏡照片之一（400×）；

圖2為本發(fā)明實施例2的共聚焦顯微鏡照片之二（1000×）；

圖3為本發(fā)明實施例4的共聚焦顯微鏡照片（1000×）。

具體實施方式

以下通過具體實施方式結合附圖對本發(fā)明的技術方案進行進一步的說明和描述。

實施例1

（1）按產品說明書操作，將近紅外熒光材料Alexa680（invitrogen公司）與尼妥珠單克隆抗體（百泰公司）偶聯(lián)，制備熒光標記的尼妥珠單克隆抗體探針（Alexa680–Nim）；

（2）取對數(shù)生長期的口腔鱗癌CAL27細胞消化后，倒置相差顯微鏡下計數(shù)，離心棄上清，加入PBS調整細胞密度至2×10⁶/mL，然后將細胞懸液分至流式專用管中，100μL/管。

（3）加入Alexa680–Nim，使其在PBS中的終濃度為25μg/mL，4℃避光孵育半小時。

（3）標記實驗：分實驗組和對照組

實驗組：加入Alexa680–Nim，使其在PBS中的終濃度為25μg/mL，4℃避光孵育半小時；

對照組：包括以下四組，其余處理及孵育條件與實驗組相同