[發明專利]一種高溫木聚糖酶和一種高溫木糖苷酶的基因及其蛋白表達和應用

在審

• 申請號: 201310741500.6
• 申請日: 2013-12-27
• 公開（公告）號: CN104745612A
• 公開（公告）日: 2015-07-01
• 發明（設計）人: 韓業君;米朔甫;彭小偉;賈曉靜;喬瑋博
• 申請（專利權）人: 中國科學院過程工程研究所
• 主分類號: C12N15/56
• 分類號: C12N15/56;C12N9/42;C12N15/10;C12N15/70;C12N1/21;C12P19/14
• 代理公司: 無
• 代理人: 無

技術領域

本發明屬于基因工程和生物質利用領域，具體涉及一種高溫木聚糖酶基因和一種高溫木糖苷酶基因及其蛋白表達與應用。

背景技術：

半纖維素是自然界中數量最大、最重要的可再生利用的生物質之一。木聚糖是半纖維素中最主要的組分。木聚糖結構復雜，主鏈由通過β-1,4-糖苷鍵連接的吡喃木糖組成，并包含葡萄糖醛酸基、乙酰基，α-L-呋喃型阿拉伯糖基等側鏈。木聚糖及其酶解產物在食品、飲料、飼料、醫藥、化工、服裝和造紙等領域具有廣泛應用價值（M.Polizeli,A.Rizzatti,R.Monti?et?al.2005）。盡管天然木聚糖的酶解得到廣泛的重視，但酶協同作用低、穩定性差等因素仍然限制了其應用。本發明涉及的高溫厭氧菌C.owensensis?OL能夠在高溫環境下高效利用天然半纖維素為碳源（S.Blumer-Schuette,D.Lewis,R.Kelly?et?al.2010）。本發明從C.owensensis?OL中獲得β-1,4-木聚糖酶和β-1,4-木糖苷酶基因，并在進行大量重組表達。β-1,4-木聚糖酶能夠具有在高溫條件下（75℃）將天然半纖維素轉化低聚木糖，β-1,4-木聚糖酶和β-1,4-木糖苷酶能夠協同作用將天然木聚糖完全轉化成木糖。

發明內容

發明目的：

本發明的目的是彌補現有木聚糖降解技術的不足，提供一種高溫木聚糖酶和一種高溫木糖苷酶的基因，包含基因的重組載體和重組工程菌，以及兩種酶的蛋白表達和應用。具體包括如下：

1、一種高溫β-1,4-木聚糖酶Co?Xylanase?A的基因，其基因序列如SEQ?ID?NO.1所示，其表達的蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。

2、一種高溫β-1,4-木糖苷酶Co?Xylosidase?A的基因，其基因序列如SEQ?ID?NO.3所示，其表達的蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.4所示。

3、本發明提供包含上述木聚糖酶基因的重組載體pET-28b-XylanaseA和包含上述木糖苷酶基因的重組載體pET-28b-XylosidaseA。

4、本發明提供包含上述木聚糖酶Co?Xylanase?A和木糖苷酶Co?Xylosidase?A基因及重組載體的重組菌，所述菌株為大腸桿菌Escherichia?coli?BL21（DE3）。

5、本發明提供制備上述木聚糖酶Co?Xylanase?A和木糖苷酶Co?Xylosidase?A表達和純化的方法。

6、本發明提供上述高溫木聚糖酶Co?Xylanase?A和木糖苷酶Co?Xylosidase?A在酶解天然木聚糖和木質纖維素原料上的單獨和協同應用，優選其在水解櫸木木聚糖及其在制備低聚木糖和木糖中的應用。

技術方案：

為實現上述發明目的，本發明采用的技術方案如下：

（1）高溫木聚糖酶Co?Xylanase?A和木糖苷酶Co?Xylosidase?A基因重組載體和重組工程菌的構建。

提取熱解纖維素菌C.owensensis的基因組，設計引物分別PCR擴增木聚糖酶Co?Xylanase?A和木糖苷酶Co?Xylosidase?A的基因，再酶切連接到載體pET-28b上，轉化大腸桿菌Top10感受態細胞，篩選并通過測序鑒定陽性重組載體，提取重組載體質粒，轉化大腸桿菌BL21（DE3）感受態細胞，獲得還有重組載體的重組工程菌。

（2）上述高溫木聚糖酶Co?Xylanase?A和木糖苷酶Co?Xylosidase?A的蛋白純化和酶學活性測定。

將獲得的重組工程菌轉接培養，IPTG誘導酶蛋白表達。通過超聲波破碎細胞，高速離心和Ni-NTA?sepharose4B親和層析分離純化；然后通過SDS-PAGE電泳和分子篩鑒定蛋白分子大小和聚合態，其中高溫木聚糖酶Co?Xylanase?A以單體形式存在，高溫木糖苷酶Co?Xylosidase?A存在單體和聚體形式；最后濃縮，測定蛋白濃度，分析蛋白的酶學性質。

（3）上述高溫木聚糖酶Co?Xylanase?A和木糖苷酶Co?Xylosidase?A對天然木聚糖的應用。