[發(fā)明專(zhuān)利]一種植物光誘導(dǎo)型基因啟動(dòng)子及其應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310739014.0
• 申請(qǐng)日: 2013-12-26
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103740718A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-04-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊建平;蘇亮;習(xí)雨琳;郭林;孟凡華;宋梅芳;侯佩;方聰燕
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/113
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/113;C12N15/10;C12N15/11;C12N15/84;A01H5/00
• 代理公司: 北京路浩知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，特別涉及一種植物光誘導(dǎo)型基因啟動(dòng)子及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

植物的生長(zhǎng)發(fā)育和生命周期是不同的基因在時(shí)間和空間上有序表達(dá)的結(jié)果。高等植物基因表達(dá)調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平上，受多種順式作用元件和反式作用因子的相互作用。啟動(dòng)子是一段位于基因5’端上游區(qū)的DNA序列，它包含有增強(qiáng)或阻遏基因表達(dá)的序列和對(duì)激素或外界脅迫有應(yīng)答作用的序列，即順式作用元件，轉(zhuǎn)錄調(diào)控是通過(guò)其與轉(zhuǎn)錄因子之間的相互作用來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

植物啟動(dòng)子按其轉(zhuǎn)錄方式可以分為組成型、組織特異型和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，但不具有絕對(duì)性。組成型啟動(dòng)子廣泛應(yīng)用于植物轉(zhuǎn)基因，如常用于轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲(chóng)水稻的CaMV35S啟動(dòng)子，ubiquitin啟動(dòng)子和actin啟動(dòng)子，它能高效、持續(xù)和非特異的啟動(dòng)外源基因表達(dá)，但外源蛋白在轉(zhuǎn)基因植物中組成型表達(dá)也會(huì)帶來(lái)很多負(fù)面影響。例如，持續(xù)合成外源基因產(chǎn)物會(huì)增加植物的代謝負(fù)擔(dān)，并且這種高效表達(dá)經(jīng)常是以大量的營(yíng)養(yǎng)消耗為代價(jià)，從而直接影響了植株的生長(zhǎng)發(fā)育，表現(xiàn)為植物生長(zhǎng)延滯、植株矮小、產(chǎn)量降低等；另外，利用組成型啟動(dòng)子可能誘發(fā)基因沉默，影響轉(zhuǎn)基因技術(shù)應(yīng)用；并且，隨著人們對(duì)于轉(zhuǎn)基因植物食品安全問(wèn)題的越來(lái)越多的關(guān)注，組成型啟動(dòng)子也越來(lái)越不能滿足現(xiàn)代基因工程育種的要求。與組成型啟動(dòng)子相比，誘導(dǎo)型啟動(dòng)子只在某些物理或化學(xué)信號(hào)的刺激下或者植物發(fā)育到特定的階段，才啟動(dòng)外源基因的轉(zhuǎn)錄。它不僅能使目的基因的表達(dá)產(chǎn)物在一定時(shí)空積累，增加區(qū)域表達(dá)量，提高植株的抗逆性，同時(shí)可避免由組成型啟動(dòng)子啟動(dòng)外源基因超表達(dá)引起的對(duì)植株發(fā)育的負(fù)面影響，也可以在一定程度上解決轉(zhuǎn)基因應(yīng)用中的基因沉默和食品安全性問(wèn)題，是應(yīng)用植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)進(jìn)行基因工程育種的理想啟動(dòng)子。

光是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育最重要的因素之一，因?yàn)樗粌H作為植物感知環(huán)境的信號(hào)來(lái)源，還作為光合作用的能量來(lái)源。因此，對(duì)光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的研究有助于了解植物基因光下的轉(zhuǎn)錄調(diào)控表達(dá)模式及其調(diào)控機(jī)制，并應(yīng)用于基因工程中使外源基因伴隨植物生理狀態(tài)適度表達(dá)，同時(shí)維持轉(zhuǎn)基因植株的健康生長(zhǎng)。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明的目的是解決目前分子育種過(guò)程中，因使用組成型啟動(dòng)子，使得外源基因持續(xù)大量表達(dá)，而破壞了植物的代謝平衡，阻礙植物正常生長(zhǎng)發(fā)育的問(wèn)題，提供一種新的植物光誘導(dǎo)型基因啟動(dòng)子序列及其應(yīng)用。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明一種植物光誘導(dǎo)型基因啟動(dòng)子，其核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示，全長(zhǎng)序列為1567bp；該序列經(jīng)取代、缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)核苷酸形成的編碼同等功能氨基酸序列的由SEQ?ID?No.1衍生的核苷酸序列也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

本發(fā)明還提供了上述光誘導(dǎo)型基因啟動(dòng)子的構(gòu)建方法，具體步驟為：以玉米基因組DNA為模板，根據(jù)ZmRBCS-1基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得上述光誘導(dǎo)型基因啟動(dòng)子。

優(yōu)選地，所述玉米為B73系。

所述特異性引物的核苷酸序列為：

5’-CAAGCTT?GGTCTGTATGGAAGCTCCCAGT-3’；

5’-GGGATCC?CATGGCTGCCTGGCTGC?CTAG-3’。

其中，PCR擴(kuò)增程序?yàn)?5℃5min；94℃45sec，69℃45sec，72℃2min，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保溫保存。

本發(fā)明還提供了用于擴(kuò)增植物光誘導(dǎo)型基因啟動(dòng)子的引物對(duì)，其核苷酸序列為：

5’-CAAGCTT?GGTCTGTATGGAAGCTCCCAGT-3’；

5’-GGGATCC?CATGGCTGCCTGGCTGC?CTAG-3’。

本發(fā)明還提供了含上述光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的植物表達(dá)載體，優(yōu)選為p1-ZmRBCS-1:GUS。

本發(fā)明還提供上述啟動(dòng)子在植物基因工程中獲得光誘導(dǎo)表達(dá)目的基因的轉(zhuǎn)基因植株中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供上述啟動(dòng)子在培育轉(zhuǎn)基因玉米和水稻中的應(yīng)用。

本發(fā)明利用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子代替組成型啟動(dòng)子，可以獲得光誘導(dǎo)的特異表達(dá)的啟動(dòng)子；利用遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)將其導(dǎo)入到植物基因組中，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)目的基因的定向操作，獲得光誘導(dǎo)表達(dá)目的基因的轉(zhuǎn)基因植株；這不僅可以實(shí)現(xiàn)目的基因在轉(zhuǎn)基因植株中的定時(shí)、定點(diǎn)、定量三維調(diào)控，而且為植物轉(zhuǎn)基因應(yīng)用提供強(qiáng)有力的工具。

附圖說(shuō)明