[發明專利]貝酵母耐硫雜交育種后代的鑒定方法

有效

• 申請號: 201310738413.5
• 申請日: 2013-12-30
• 公開（公告）號: CN103740821A
• 公開（公告）日: 2014-04-23
• 發明（設計）人: 劉小珍;張漢堯
• 申請（專利權）人: 西南林業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 昆明科陽知識產權代理事務所 53111
• 代理人: 孫山明

技術領域

?本發明屬于酵母菌育種及鑒定方法。?

背景技術

酵母選育是高品質果酒釀造的核心技術之一，對果酒的香味、品質等具有決定性的影響。目前我國果酒釀造用的酵母基本都是進口的，果酒質量同質化日趨嚴重，制約了我國新品質果酒發展和竟爭力，也威脅我國野生酵母菌資源。釀酒酵母（Saccharomycesscerevisiae）是各種類型的酒生產中所通常采用的酵母，但以釀酒酵母作為發酵菌種釀造的酒風味平淡，而廣義釀酒酵母組(Saccharomycessensu?lato)已擴展到其它酵母的選育，如貝酵母（Saccharomyces?bayanus）、奇異酵母（Saccharomycesparadoxus）等酵母。?

????另一方面，硫是酵母代謝過程中的一個常見產物，具有抗菌和抗氧化兩重功能，作為果酒生產的原材料的果汁以硫作防腐劑，其原因是：硫通過鈍化磷酸-3-甘油醛脫氫酶和乙醇脫氫酶的作用，導致細菌和真菌的ATP損耗，抑制其生長發育最終使其死亡而達到抗菌防腐的作用。但硫對于酵母本身也是一種潛在的毒素，它會隨著發酵的進程而不斷的積累，當硫的濃度積累達到一定量時將影響酵母的生長、存活及發酵能力，進而限制乙醇濃度的提高，中斷發酵過程。換言之，高硫環境對釀酒過程中的酵母而言是一種常見逆境。?

貝酵母是眾多有發掘前景的酵母之一，除了可產生特殊風味，還表現出了其它的優良性狀，如對低溫的耐受性比釀酒酵母更強等（Naumov等，2002；Nguyen等，2011），已在目前果酒生產中占有一定的地位，并有良好的市場開發前景，對它的深入研究將使其在未來的果酒生產中扮演重要角色。然而，目前有關酵母耐硫機理的研究基本都集中于釀酒酵母，貝酵母與釀酒酵母在物種水平上相比，基因組間存在很大差異，而貝酵母的耐硫能力很差，硫耐受機理的較大差異是后期影響發酵的主要因素之一（Bashtannaya，1970），如果能在果酒發酵后期在酒精濃度較高的脅迫下當其它酵母失去發酵功能后繼續把果汁中的糖轉化為酒精，就意味著貝酵母必須能耐受高濃度的硫，但對耐硫機理的研究，國內外均無報道。因此，開展貝酵母耐硫菌株選育和培育，提高其硫耐受性是果酒釀造所用酵母選育研究勢在必行的重要目標。?

????酵母菌的繁殖方式分有性繁殖和無性繁殖兩種，以無性繁殖為主。很多酵母菌的二倍體細胞可以進行多代的營養生長繁殖，因而，在酵母菌生活周期中，存在著單倍體細胞和二倍體細胞兩種類型，都可以獨立生活。二倍體酵母菌細胞個大，生活力強，故發酵工業常利用二倍體酵母菌進行生產。傳統的鑒定方法是通過形態學、生理生化性狀等對釀酒酵母進行鑒定，將實驗結果與標準系統進行對比得出鑒定結論。而酵母屬菌種顯微形態主要以單細胞形式存在，顯微觀察結果表明各種內菌株間的細胞性狀很接近，準確率較低，幾乎觀察不到差異，無法準確地將雜交后代與雜交親本區分開來。（劉小珍、張漢堯，“昆明葡萄酒相關酵母菌的分離與鑒定”，西北農林科技大學學報(自然科學版，已接收)，2014）。?

近年來，隨著分子生物學的發展，由于分子標記技術能在?DNA水平上迅速、有效的鑒定體細胞雜種，并且能在苗期進行，節省大量的時間和精力。因此，分子標記技術被廣泛應用于雜種的鑒定。目前，分子標記的方法主要有?RFLP、RAPD、ISSR?和?AFLP等（Zietkiewicz?等，1994；Liu等，2009；Zhang等，2009）。由于ISSR?標記使用比?RAPD?引物更長的引物，?克服了?RAPD?標記穩定性和重復性差等缺點，操作簡單，重復性好，多態性高，而且不需知道被檢測物種任何基因組的信息（Zietkiewicz?等，?1994），已用于黑木耳（汪思迪等，?2009）等遺傳多樣性的檢測分析。?

發明內容

本發明旨在以耐硫貝酵母菌株為耐硫親本與其它貝酵母菌株進行雜交培育貝酵母耐硫新菌株，并提供一種貝酵母耐硫雜交后代的鑒定方法，為此而提出一種快速有效地培育貝酵母耐硫新菌株及有效篩選雜交后代的鑒定方法。?

本發明貝酵母耐硫雜交育種的后代鑒定方法，包括以下步驟：?

???（1）貝酵母雜交：參照Codon等（1995）的方法進行；

???（2）貝酵母菌株耐硫性測定：

將不同菌株接種于新鮮的含15?mg/L?亞硫酸鈉的YPD(pH?3.5，含琥珀酸鹽)上，能長起來的為耐硫菌株，不能長起來的為非耐硫菌株；

???（3）提取和純化貝酵母DNA：