[發(fā)明專利]一種基于量子點的雙夾心免疫熒光定量檢測人抗苗勒氏管激素AMH的試劑盒制備方法及其應(yīng)用

無效

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• 申請日: 2013-12-25
• 公開（公告）號: CN103728459A
• 公開（公告）日: 2014-04-16
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 夏曦;管亞楚
• 申請（專利權(quán)）人: 李志榮
• 主分類號: G01N33/74
• 分類號: G01N33/74;G01N21/64
• 代理公司: 廣州嘉權(quán)專利商標事務(wù)所有限公司 44205
• 代理人: 陳國榮

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于免疫診斷技術(shù)領(lǐng)域，涉及基于量子點的免疫熒光定量檢測，具體涉及一種基于量子點的雙夾心免疫熒光定量檢測人抗苗勒氏管激素(AMH)的試劑盒及其制備和應(yīng)用。

背景技術(shù)

目前臨床上國內(nèi)各診療單位評估卵巢功能主要根據(jù)年齡、竇卵泡的數(shù)目（Antral?follicle?count）、濾泡刺激激素（FSH）和雌激素（E2）水平等。但上述傳統(tǒng)方法檢查容易受到各種因素影響而產(chǎn)生誤差，同時容易受到檢測者主觀判斷而產(chǎn)生結(jié)果偏倚；此外，上述指標的檢測受月經(jīng)周期的時限制約，且其檢測數(shù)值受到月經(jīng)周期的波動而波動，因而無法準確及時給予判斷。能否尋找某一有效穩(wěn)定指標，在月經(jīng)不同時期均能有效評估卵巢功能是目前婦科生殖內(nèi)分泌面臨的主要問題之一。近年來在歐美國家，臨床上逐漸開始使用抗苗勒氏管激素（Anti-Mullerian?hormone:AMH）作為卵巢功能評估的一項指標。AMH是由二硫鍵連接而成的糖蛋白二聚體、僅在性腺中表達，其主要由處于生長期卵泡中顆粒細胞所分泌，AMH在調(diào)控卵泡生長和發(fā)育，維持卵巢儲備功能中發(fā)揮重要作用。研究表明：AMH水平與卵巢儲備功能呈明顯正相關(guān)，在優(yōu)勢卵泡選擇發(fā)面也起到了重要作用，因此檢測女性血液中的AMH的含量，可以作為評估卵巢儲備能力的有效指標之一。

目前在歐美，大部分臨床診療中心已將AMH水平作為評估卵巢儲備的常規(guī)指標。所采用的主要為酶免疫測定。但是，酶免疫分析法靈敏度低，影響因素較多，易造成假陰性和假陽性結(jié)果。量子點（QDs）具有連續(xù)而寬的激發(fā)光光譜。其熒光可被波長小于其量子限域峰的任意光源所激發(fā)，且熒光譜峰位置可以通過改變量子點物理尺寸進行調(diào)控。這樣僅用一種波長的激發(fā)光源便可激發(fā)多種不同顏色熒光的量子點進行多元熒光檢測。有效提高了分辨率和靈敏度。因此，量子點免疫分析法遠遠優(yōu)于酶免疫測定。

目前國內(nèi)尚無自主知識產(chǎn)權(quán)的AMH臨床診斷試劑盒。國內(nèi)部分診療機構(gòu)已引進該試劑盒并進行相關(guān)臨床檢測，但其價格相對昂貴，無法得到有效臨床推廣。目前國內(nèi)尚也未見采用量子點免疫分析方法檢測AMH的注冊試劑盒供應(yīng)，該項檢測在臨床上的研究也還未廣泛展開。且目前國外的AMH檢測試劑盒多采用的是酶聯(lián)免疫方法，但是，酶免疫分析法靈敏度低，影響因素多，易造成假陰性和假陽性。而根據(jù)大量的試驗結(jié)果及臨床應(yīng)用資料，從實用性、穩(wěn)定性、準確性及臨床應(yīng)用前景來看，量子點免疫分析法遠遠優(yōu)于酶免疫測定。因此，有必要研發(fā)出具有自主知識產(chǎn)權(quán)、結(jié)合量子點免疫分析方法，同時具有高分辨率、靈敏度及特異性的AMH診斷試劑盒，用于準確、快速評估卵巢的儲備功能。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種量子點免疫熒光定量檢測抗苗勒氏管激素(AMH)的試劑盒。

本發(fā)明的另一目的在于提供上述試劑盒在檢測卵巢儲備功能中的應(yīng)用。

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

一種基于量子點的雙夾心免疫熒光定量檢測人抗苗勒氏管激素AMH的試劑盒，該試劑盒包括AMH蛋白標準品，包被AMH特異性多克隆抗體的酶標板，CdTe量子點標記的AMH單克隆抗體。

進一步的，上述AMH蛋白標準品為原核細胞表達的重組蛋白，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。

進一步的，上述AMH特異性多克隆抗體是以原核表達的AMH重組蛋白作為免疫原合成的兔抗人AMH多克隆抗體。

進一步的，上述AMH單克隆抗體是以原核表達的AMH重組蛋白作為免疫原合成的鼠抗人AMH單克隆抗體。

進一步的，本發(fā)明試劑盒還包括：標記抗體稀釋液、洗板液、封閉液和樣品稀釋液。

本發(fā)明的有益效果是：

試劑盒中作為檢測抗體的單克隆抗體，由于采用的量子點標記法具有激發(fā)光譜寬，自發(fā)熒光弱，熒光穩(wěn)定和半衰期長等特點，大大的提高了檢測的分辨率、靈敏度和特異性。

本發(fā)明的試劑盒以CdTe量子點標記鼠抗人AMH單克隆抗體作為檢測抗體，更好的去除背景信號，提高檢測的分辨率和靈敏度；且通過熒光酶標儀測量熒光強度獲得檢測結(jié)果，所發(fā)射的熒光譜峰狹窄，自發(fā)熒光弱，靈敏度高；熒光強度高，穩(wěn)定時間長；克服了現(xiàn)有的抑制素B酶免疫檢測試劑盒靈敏度低，特異性差的現(xiàn)狀，提高檢測的分辨率、靈敏度及特異性，更為有效地對早期卵巢儲備功能進行檢測及風(fēng)險評估。

本發(fā)明用量子點免疫分析法檢測AMH是先進而有效的方法，能夠有效的提供臨床檢測的分辨率、靈敏度及特異性，且檢測方法操作簡便，實用性強。

附圖說明

圖1為人AMH重組蛋白純化前后的western?blotting圖片；