[發明專利]一種來源于惡臭假單胞菌的EPSP合酶基因及其應用

有效

• 申請號: 201310737930.0
• 申請日: 2013-12-26
• 公開（公告）號: CN103695446A
• 公開（公告）日: 2014-04-02
• 發明（設計）人: 夏勉;徐海英;徐沫文;張斌
• 申請（專利權）人: 北京未名凱拓作物設計中心有限公司
• 主分類號: C12N15/54
• 分類號: C12N15/54;C12N9/10;C12N15/63;C12N1/21;C12N1/19;C12N5/10;C12N15/84;A01H5/00;C12Q1/68;C12Q1/48
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技術領域

本發明屬于微生物基因工程領域和植物遺傳工程學領域，具體涉及一種來源于惡臭假單胞菌的EPSP合酶基因及其在轉基因植物中的應用。

背景技術

草甘膦（N-phosphonomethyl-glycine,?glyphosate）是一種有機磷除草劑。20世紀70年代初由孟山都公司開發，通常使用時一般將其制成異丙胺鹽或鈉鹽。其異丙胺鹽是著名除草劑商標“Roundup”的活性成分。

草甘膦是一種廣譜滅生性、內吸傳導型優秀除草劑，是全世界使用量最大的除草劑之一。草甘膦的除草性能優異，極易被植物葉片吸收并傳導至植物全身，對一年生及多年生雜草都有很高的活性。但是該除草劑是一種非選擇性除草劑，對農作物同樣具備殺傷力。為使在農作物生產中更廣泛的使用草甘膦，必須培育出具有抗草甘膦抗性或降解性的農作物。

草甘膦的毒性作用機理是競爭性抑制莽草酸途徑中的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶（5-enolpyruvyl-shikimate-3-phosphate?synthase,?EPSPS，簡稱EPSP合成酶）的活性。EPSP合成酶是植物和微生物體內芳香族氨基酸，色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等生物合成過程中的一個關鍵酶。草甘膦可以通過植物的韌皮部進行運輸，并與EPSP合成酶結合，從而阻斷芳香族氨基酸的生物合成，引起細胞死亡。

草甘膦也能抑制大部分細菌中芳香族氨基酸的生物合成中EPSP合成酶活性，但是部分細菌的EPSPS已發現對草甘膦具有抗性，并且被克隆獲得。植物可以通過轉基因表達細菌的抗性EPSPS而獲得抗草甘膦的能力。例如農桿菌(Agrobacterium?tumefaciens?sp?CP4)和Salmonella?typhimurium?CT7的EPSPS在植物中表達而獲得的抗性已在生產中應用（美國專利453590,4769061,5094945）。但是為了提高轉基因農作物的抗性水平和增加抗性基因的多樣性，生產應用中仍然需要新的抗草甘膦基因和以此為基礎的抗草甘膦轉基因植物。

????我國在轉基因抗草甘膦作物方面的研究已取得一定進展，但目前尚無抗草甘膦轉基因作物進入商品化階段的報道。因此，本領域迫切需要開發新的抗草甘膦的EPSPS，從而獲得抗草甘膦轉基因植物。

本發明從污泥中篩選到一株具有草甘膦抗性的細菌，利用其基因組序列的信息克隆了其EPSPS基因，并且進一步在擬南芥、玉米、水稻、棉花、大豆等植物中證明了這個EPSPS基因的抗草甘膦能力及其在發展轉基因抗草甘膦農作物中的用途。

發明內容

本發明所要解決的技術問題在于提供新的使植物具有草甘膦抗性的基因及其編碼蛋白。另外，本發明還提供了這個基因的基因工程中間體（如，表達盒、載體和細胞等），獲得具有草甘膦抗性的植物的方法和應用，并提供了判斷植物是否具有草甘膦抗性的鑒定方法。

具體而言，在第一方面，本發明提供了一種對草甘膦具有高抗性的新基因，本發明所提供的草甘膦抗性基因，是發明人篩選并克隆到的一種新的EPSP合酶基因（以下稱為P-EPSP合酶基因）。P-EPSP合成酶基因是用PCR方法從發明人篩選的高草甘膦抗性菌株惡臭假單胞菌（Pseudomonas?putida?）KT-CGL-7-6中克隆得到的。Pseudomonas?putida?KT-CGL-7-6為本發明人從噴灑草甘膦的試驗田土壤中經初篩和復篩等大量的實驗得到的對草甘膦具有高耐受活性的菌株。菌株KT-CGL-7-6于2013年1月23日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC?NO.7190，保藏單位的地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號?中國科學院微生物研究所。P-EPSP合酶基因是下述核苷酸序列之一：

1）序列表中SEQ?ID?NO：1所示的核苷酸序列；

2）與SEQ?ID?NO：1序列具有90％以上相似性且編碼相同功能蛋白質的DNA序列；

3）與SEQ?ID?NO：1相比，具有SEQ?ID?NO：1序列的部分、區段和/或片段（包括臨近片段和與全長分子相比內部和/或末端缺失）、其變體、突變體、嵌合體和融合物且可編碼賦予高草甘膦抗性活性的蛋白質的核苷酸序列；

4）根據SEQ?ID?NO：1，利用同一個氨基酸的不同密碼子而獲得的不同的核苷酸序列，這些序列編碼高草甘膦抗性活性的蛋白質多肽；

5）通過導入SEQ?ID?NO：1所示的核苷酸序列的其他變異但是仍然編碼具有抗草甘膦能力的蛋白質的核苷酸序列。