[發明專利]一種用于檢測豬流行性腹瀉病毒的方法

有效

• 申請號: 201310737312.6
• 申請日: 2013-12-24
• 公開（公告）號: CN103805712A
• 公開（公告）日: 2014-05-21
• 發明（設計）人: 張志剛;董劍輝;張文利;張曉杰;李爽
• 申請（專利權）人: 北京偉嘉人生物技術有限公司;沈陽偉嘉牧業有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
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• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種豬病毒的檢測方法，屬于生物技術領域，具體涉及豬流行性腹瀉病毒的PCR檢測引物及檢測方法。?

背景技術

豬流行性腹瀉(PED)由豬流行性腹瀉病毒(PEDV)引起的以腹瀉、嘔吐和脫水為特征的豬腸道傳染病。該病多發生在冬春寒冷季節，哺乳仔豬、架子豬或育肥豬等各年齡段均可發病，但哺乳仔豬發病和死亡最為嚴重。20世紀80年代后該病在中國流行面逐漸擴大，并多與豬傳染性胃腸炎、輪狀病毒等其他腸道病原混合感染，給養豬業造成嚴重經濟損失。?

該病的流行特點、臨診癥狀和病理變化都與豬傳染性胃腸炎(TGE)非常相似，為了及時預防和治療該病毒導致的腹瀉，需要快速鑒別診斷豬流行性腹瀉病毒的特異方法，因此建立PEDV的RT-PCR檢測方法具有重要的意義。?

發明內容

本發明的目的是提供一種豬流行性腹瀉病毒的RT-PCR引物及檢測方法，該方法通過設計豬流行性腹瀉病毒基因的特異引物，建立豬流行性腹瀉病毒的RT-PCR方法，為方便、快速、有效地檢測該病毒打下基礎。?

1.一種用于檢測豬流行性腹瀉病毒的方法，包含RT-PCR的檢測PED病毒，其特征在于：所述RT-PCR引物：?

PEDVF：AACGGTTCTATTCCCGTTGATG?

PEDVR：TAAATGAAGCACTTTCTCACTATC?

2.根據權利要求1所述的一種用于檢測豬流行性腹瀉病毒的方法，其特征在于：PED病毒RT-PCR的檢測方法首先提取待檢樣的RNA，通過反轉錄形成cDNA，然后以反轉錄的cDNA為模板，建立PEDV的RT-PCR檢測，RT-PCR的產物為663bp。?

3.根據權利要求2所述的PEDV的RT-PCR檢測方法，其特征在于：所述的RT-PCR檢測方法具體包括以下步驟：?

(1)待檢樣RNA的提取；?

(2)將提取的RNA通過反轉錄成cDNA，反應程序和反應體系如下：?

取總RNA5.75ul、反向引物RNA1ul、10mmol／L?dNTPs0.5ul、5×Buffer2ul、100U／ul反轉錄酶AMV0.5ul、RNA酶抑制劑0.25ul，總體積10ul，50℃反應1h，95℃滅活5min，即得cDNA。?

(3)將獲得的反轉錄產物進行PCR擴增，反應體系和反應程序如下：?

取RT產物1ul，2×Mix12.5ul，正向引物和反向引物各1ul，高壓滅菌水9.5ul，總體積25ul，置入PCR?儀，反應條件：94℃30second，56℃30second，72℃20second，35個循環，即得擴增產物。?

(4)RT-PCR產物的檢測結果：根據瓊脂糖凝膠電泳檢測的DNA圖譜，若擴增出分子量為663bp的特異DNA條帶則標記為攜帶PED病毒，若未擴增出特異DNA條帶則表示未攜帶PED病毒。?

與現有技術相比，本發明具有以下有益效果：?

本發明的引物特異性高，鑒定速度快，整個RT-PCR過程可以在2.5-3小時完成，不需要經過測序公司測序就能快速準確的鑒定PEDV，為臨床檢測節省大量時間。?

附圖說明

圖1PEDVPCR擴增電泳結果?

圖2PEDV?RT-PCR特異性電泳圖結果?

圖3PEDVRT-PCR敏感性電泳圖結果?

具體實施方式

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法；所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。?

實施例豬流行性腹瀉病毒RT-PCR檢測方法建立。?

1引物設計：在GenBank中查找多個毒株，對其進行同源性分析，利用Primer5對上述保守區進行引物設計，對設計出來的病毒檢測引物進行引物二聚體分析，以避免引物之間形成穩定的引物二聚體，從而確定該病毒的引物序列，見表1。?

表1?

2、RT-PCR反應條件優化?

利用商品化的RNA提取試劑盒提取疑似PEDV致死仔豬的腸及其內容物，提取方法參照RNA提取試劑盒操作說明進行。?