[發(fā)明專利]降低牛、羊精液中畸形精子比率和死精子比率的方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310737256.6
• 申請(qǐng)日: 2013-12-30
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103710303A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-04-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 丁瑞;周文忠;韓紅梅;李喜和;胡樹(shù)香
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 內(nèi)蒙古賽科星繁育生物技術(shù)股份有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/076
• 分類號(hào): C12N5/076
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

1.一種降低牛、羊精液中畸形精子比率和死精子比率的方法，其特征在于：它包括如下步驟：

(一)、Staining??Talp稀釋液的配置：

NaHCO_{3?????????????????????????????????????????}10mmol/L，

????????Hepes?????????????????????40mmol/L，

MgCl_{2???????????????????????????????????????????}0.4mmol/L，

NaLactate?????????????????25mmol/L，

KCl???????????????????????3mmol/L，

Glucose???????????????????5mmol/L，

NaCl??????????????????????95mmol/L，

Na₂HPO_{4????????????????????????????????????????}0.3mmol/L，

NaPyruvate????????????????2mmol/L，

0.3%BSA???????????????????3g/L；

以上成分依次溶解入超純水中，最終體積定容至1L；

（二）、Staining??Talp稀釋液的保存：??????

????Staining??Talp稀釋液保存在4℃，保存期限為兩周；

（三）、上游法處理新鮮精液：

（1）提前37℃預(yù)熱容器，再將4ml?Staining??Talp稀釋液預(yù)熱至37℃后，置于容器內(nèi)；

（2）選取活力區(qū)間為40%-60%的新鮮精液，取1ml注入容器內(nèi)Staining??Talp稀釋液的底部，37℃溫浴30分鐘；

（3）吸出頂部4ml精液，將吸出的4ml精液3000rpm/min離心5分鐘，棄掉3?ml上清液，保留底部1ml精液；

?（四）、精液各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)：

（1）精子活力檢測(cè)：

預(yù)先把載玻片和蓋玻片放在37℃加熱板上預(yù)熱10分鐘，用移液器離心管從步驟（三）（3）的底部1ml精液中取15μl樣品，滴在準(zhǔn)備好的載玻片上，壓片后置于顯微鏡下鏡檢，選擇壓片均勻的樣品區(qū)域觀察，一個(gè)壓片取5個(gè)視野，中間1個(gè)，四周各取1個(gè)，分別計(jì)數(shù)活精子數(shù)和死精子數(shù)，并計(jì)算活力；

精子活力=活精子數(shù)/活精子數(shù)與死精子數(shù)的和；

（2）畸形率檢測(cè)：

A、從步驟（三）（3）的底部1ml精液中取一滴精液滴于載玻片一端，用另一邊緣光滑的載玻片與有樣品的載玻片成35°夾角，將樣品均勻地涂抹于載玻片上，自然風(fēng)干約5?min，每樣品制作2個(gè)抹片；

B、在已風(fēng)干的抹片上滴上1.0?mL～2.0?mL0.05%福爾馬林，pH值為6.5-7.5，固定15?min后用清水緩緩沖去福爾馬林，吹干或自然風(fēng)干；

C、將固定好后的抹片反扣在帶有平槽的有機(jī)玻璃面上，把姬姆薩染液滴于槽和抹片之間，讓其充滿平槽并使抹片接觸染液，染色1.5?h后用清水緩緩沖去染液，晾干待檢；

D、鏡檢：將步驟C中晾干待檢的抹片置于400倍～600倍顯微鏡下觀察，每個(gè)抹片觀察200個(gè)以上的精子，分左、右二個(gè)區(qū)，取2片的平均值，2片的變異系數(shù)不得大于20%，若超過(guò)應(yīng)重新制片；

畸形率=畸形精子數(shù)/總精子數(shù)；

（3）精子總數(shù)：

從步驟（三）（3）的底部1ml精液中取精液50ul，用950ul的0.05%福爾馬林溶液將精液稀釋20倍，再進(jìn)行20倍稀釋，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，在顯微鏡調(diào)至自然光下，計(jì)數(shù)精子濃度。