[發明專利]水稻轉基因遺傳轉化方法

無效

• 申請號: 201310731487.6
• 申請日: 2013-12-26
• 公開（公告）號: CN103740752A
• 公開（公告）日: 2014-04-23
• 發明（設計）人: 朱永興;許興;李樹華;白海波;呂學蓮;董建力;關雅靜;張巖;麻冬梅
• 申請（專利權）人: 寧夏農林科學院
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;A01H5/00;A01H4/00
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司 11246
• 代理人: 龔燮英

1.一種水稻轉基因遺傳轉化方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1.0）愈傷組織誘導

即選取飽滿的水稻種子剝去穎殼，用乙醇浸泡，隨后用升汞溶液浸泡，再用無菌水漂洗，之后接種于誘導培養基上培養；愈傷組織經過2～3次繼代后，挑選生長狀況較好、組織松散、淡黃色顆粒狀的愈傷組織繼代備用；

（2.0）饑餓處理

即挑選上述步驟（1.0）繼代后生長狀況較好、組織松散、淡黃色顆粒狀的愈傷組織置于瓶中，在合適溫度下饑餓處理，備用；

（3.0）侵染

（3.1）在無菌條件下，從固體細菌培養基上挑取一株農桿菌單菌落接于含有抗生素的液體細菌培養基中，在恒溫搖床上振蕩過夜培養；

（3.2）將上述步驟（3.1）中過夜培養的菌液轉至離心管中離心，收集菌體；

（3.3）將上述步驟（3.2）離心后的菌液棄去離心管中的上清液，再向收集的菌體中加入適量新鮮的液體細菌培養基，接著從離心管中取出適量的菌液加入到液體細菌培養基中，直至農桿菌的濃度適當即可，再加入乙酞丁香酮，用于侵染農桿菌；

（3.4）將上述步驟（2.0）中饑餓處理后的胚性愈傷組織置于一定濃度的鈣離子侵染液中侵染一定時間后，再置于濾紙上吸干備用；

（4.0）培養

（4.1）共培養，即將上述步驟（3.4）獲得的愈傷組織轉置共培養培養基中，在合適溫度條件暗培養；

（4.2）恢復培養，即將上述步驟（4.1）中獲得的愈傷組織用無菌水清洗，然后用無菌濾紙吸干，轉置恢復培養基中，在合適溫度條件下光照培養；

（4.3）篩選培養，即將上述步驟（4.2）獲得的愈傷組織轉置篩選培養基中，在合適溫度條件光照培養，并根據情況適時更換培養基；

（4.4）分化培養，即將上述步驟（4.3）獲得新鮮、疏散且呈淡黃色的愈傷組織放置于分化培養基中培養，在合適溫度條件光照培養，并根據情況適時更換培養基；待分化出的不定芽長到一定長度時，將其小心移入生根培養基中誘導生根。

2.如權利要求1所述的水稻轉基因遺傳轉化方法，其特征在于：所述步驟（1.0）中將剝去穎殼的種子用70%～75%乙醇浸泡4～5min，隨后用0.1%～0.2%的升汞溶液浸泡10～20min，再用無菌水漂洗3～5次，之后接種于誘導培養基上培養；

所述誘導培養基由N6培養基、2.0mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸、2.0mg/L的脫落酸、0.5g/L的L-脯氨酸、0.5g/L的水解酪蛋白、30g/L的蔗糖及7g/L的瓊脂粉組成。

3.如權利要求1所述的水稻轉基因遺傳轉化方法，其特征在于：所述步驟（2.0）中是將挑選好的愈傷組織置于100～200mL三角瓶中，在20～25℃的溫度條件下饑餓處理2～5天，備用。

4.如權利要求1所述的水稻轉基因遺傳轉化方法，其特征在于：所述步驟（3.1）中是將挑取的農桿菌單菌落接于50～100mL含有40～60mg/L抗生素的液體細菌培養基中，在25～28℃，150～200r/min的恒溫搖床上振蕩過夜培養；

所述步驟（3.2）是將所述步驟（3.1）中過夜培養的菌液轉至離心管中，在4～6℃下，4000～6000rpm/min，離心8～15min，收集菌體；

所述步驟（3.3）中是將從離心管中取出適量的菌液加入到含有20～50mM?CaCl₂的液體細菌培養基中，直至農桿菌的濃度適當即可，再加入80～100μL10～20mg/mL的乙酞丁香酮，用于侵染農桿菌；

所述步驟（3.4）中是將所述步驟（1.0）中繼代好的胚性愈傷組織置于一定濃度的鈣離子侵染液中侵染30～60min。

5.如權利要求1所述的水稻轉基因遺傳轉化方法，其特征在于：所述步驟（4.1）中是將第三步獲得的愈傷組織轉置于共培養培養基中，在22～28℃的溫度條件暗培養2～4天；

所述共培養培養基由N6培養基、2.0mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸、20mg/L的乙酰丁香酮、0.5g/L的L-脯氨酸、0.5g/L的水解酪蛋白、30g/L的蔗糖及7g/L的瓊脂粉組成。