[發明專利]一種利用釀酒酵母合成原人參二醇的方法

在審

• 申請號: 201310730918.7
• 申請日: 2013-12-25
• 公開（公告）號: CN103642888A
• 公開（公告）日: 2014-03-19
• 發明（設計）人: 趙壽經;王雪松;錢延春;王樂;安巖;郝東云;梁彥龍;徐立新
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: C12P33/00
• 分類號: C12P33/00;C12N15/81;C12R1/865
• 代理公司: 長春市四環專利事務所(普通合伙) 22103
• 代理人: 張建成

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及西洋參基因PqDS和PqD12H，兩種重組的酵母菌表達質粒pAUR123-PqDS和pAUR123-PqD12H，一種可合成原人參二醇的重組釀酒酵母菌CICC-pAUR123-PqDS-PqD12H及其制備方法。

背景技術

人參和西洋參中的主要成分均是人參皂苷，人參皂苷具有多種藥理活性，如抗癌、抗疲勞、抗衰老和抗糖尿病等。近年來通過發根農桿菌轉化人參組織細胞獲得的人參發根，生長速度快，遺傳和生物合成性狀穩定，因此被認為是最具潛力的人參皂苷生產途徑。然而，發根中皂苷含量較低，成為其工業化生產的主要瓶頸之一。通過代謝工程手段，基于人參皂苷生物合成途徑，來提高人參發根皂苷的生物合成水平，是解決這一問題的有效手段。人參皂苷生物合成途徑和人參皂苷生物合成關鍵酶基因的克隆是現階段的研究熱點。

目前認為人參皂苷是先經由異戊二烯途徑合成2，3-氧化角鯊烯，然后2，3-氧化角鯊烯在經由后續步驟的羥基化、糖基化修飾最終生成各種人參單體皂苷。2，3-氧化鯊烯是甾醇和三萜等代謝產物生物合成的共同前體，也是異戊二烯途徑的終產物。其生物合成路線為MVA途徑生成的IPP及其異構化的DMAPP在牛兒基焦磷酸合成酶（GPS）作用下首先形成牛兒基焦磷酸（GPP），接著利用法尼基焦磷酸合成酶（FPS）轉化成法尼基焦磷酸（FPP），又在鯊烯合成酶（SS）等的作用下合成鯊烯，然后經鯊烯環氧酶（SE）催化轉變為2，3-氧化鯊烯。2，3-氧化鯊烯在環化酶的作用下生成植物甾醇和三萜類骨架。具體路線（1）2，3-氧化鯊烯在環阿橋醇合成酶（CAS）的作用下合成環阿橋醇，再經過一系列的催化反應生成植物甾醇；（2）2，3-氧化鯊烯在達瑪烯二醇合成酶（DS）的作用下合成達瑪烯二醇,生成的達瑪烯二醇在酶的進一步的催化作用下將會合成具有生理活性的各種單體皂苷。

細胞色素P450（CYP450）是一類超基因家族編碼的含有血紅素的氧化酶類，分布于各種需氧生物體內，如植物、動物、真菌以及細菌等。在人參皂苷的合成途徑中，P450對人參皂苷碳環骨架進行羥基化、氧化等復雜修飾作用，是人參皂苷合成途徑中最為復雜的過程，最終決定人參皂苷單體的多樣性。研究表明，在人參皂苷的合成途徑中P450基因具有催化達瑪烯二醇C-12位羥基化生成原人參二醇的原人參二醇合成酶（D12H）的功能。如何從P450家族眾多基因中找出參與人參皂苷生物合成的基因并鑒定其功能，是通過生物工程合成重要藥理作用的稀有人參皂苷的瓶頸。

目前，萜類的代謝工程研究常在大腸桿菌和酵母菌中進行基因操作。在大腸桿菌中，萜類環化酶基因表達及萜類化合物的生產受到諸多因素的限制。首先，體內異戊二烯合成前體物質的缺乏是一個重要的制約因素，其次，環化酶表達水平低下是限制萜類產量的另一重要因素。與大腸桿菌相比較，酵母表現出更活躍的異戊二烯代謝功能，基于以上分析及食品安全方面考慮，因此選取釀酒酵母作為宿主菌。

發明內容

本發明的目的是提供一種利用釀酒酵母合成原人參二醇的方法，是一種在釀酒酵母菌中體外表達原人參二醇的方法，從而克服了西洋參中原人參二醇合成效率低，生產周期長，提取純化困難等方面的問題。

原理為釀酒酵母中天然存在2，3-氧化角鯊烯，轉入西洋參的達瑪烯二醇合成酶和原人參二醇合成酶基因后，表達生成的達瑪烯二醇合成酶可直接催化酵母中的2，3-氧化角鯊烯生成達瑪烯二醇，原人參二醇合成酶可催化達瑪烯二醇生成原人參二醇。

本發明中用到的西洋參中的基因PqDS和PqD12H為申請人在西洋參中首次，獲得發現并克隆的兩個與原人參二醇生物合成有關的新基因，現已發表在GeneBank上，基因登陸號為PqDS（KC316048）和PqD12H（JX569336）。

本發明利用pAUR123DNA質粒為穿梭載體，能夠存在于大腸桿菌和釀酒酵母菌中，并且具有不同的篩選標記的特性，分別構建PqDS和PqD12H的表達載體pAUR123-PqDS和pAUR123-PqD12H，將兩個表達載體pAUR123-PqDS和pAUR123-PqD12H轉化到同一個釀酒酵母菌中獲得重組釀酒酵母菌CICC-pAUR123-PqDS-PqD12H，從而實現在釀酒酵母菌中表達原人參二醇。

本發明的有益效果：

本發明利用釀酒酵母合成原人參二醇，合成效率高，生產周期短，純化容易，生產成本低。

附圖說明

圖1是西洋參基因PqDS?PCR擴增后電泳圖。

圖2是西洋參基因PqD12H?PCR擴增后電泳圖。