[發明專利]一種基于紅鰭東方鲀FoxO1基因的重組蛋白、制備方法及應用

有效

• 申請號: 201310729525.4
• 申請日: 2013-12-25
• 公開（公告）號: CN103709242A
• 公開（公告）日: 2014-04-09
• 發明（設計）人: 楊志軍;張偉;何廣杰;張煜;倪天軍;王翠玲;石如玲
• 申請（專利權）人: 新鄉醫學院
• 主分類號: C07K14/46
• 分類號: C07K14/46;C12N15/12;C12N15/70;A61K38/17;A61P3/00;A23K1/16;A23K1/18
• 代理公司: 鄭州睿信知識產權代理有限公司 41119
• 代理人: 牛愛周

技術領域

本發明具體涉及一種基于紅鰭東方鲀FoxO1基因的重組蛋白，以及該重組蛋白的制備方法和應用，屬于生物技術領域。

背景技術

脂質是生物體的主要構成成分，與能量的貯存和細胞內信號傳導途徑等很多生理功能密切相關。魚類的主要脂質沉積部分是肝臟與肌肉，但在這兩種組織中脂質的存在的比例也隨著魚種的不同有著很大的差異，河豚魚和比目魚等魚種的脂質主要貯存在肝臟（瘦魚），其他的魚種如真鯛和鰻魚等魚類的脂質同時存在于肝臟和肌肉（肥魚）。組織學研究表明鮭科魚的肌肉脂質主要被沉積在脂肪細胞即魚肉的肌膈上。真鯛的脂肪細胞是由前脂脂肪細胞分化而來的，并且過氧化物酶體增殖激活受體（peroxisome?proliferator-activated?receptors，PPARs）參與調控，雖然其參與脂肪細胞分化的詳細機制不太清楚，很可能是瘦魚和肥魚在脂肪細胞的分化過程中有不同的分子調控網絡。PPARs家族有三個成員：PPARα、PPARβ、PPARγ，在脂質穩態中發揮重要調控作用。PPARα和PPARβ主要參與脂肪酸氧化代謝，PPARγ主要參與脂肪生成。PPARγ被配體激活調節脂類代謝靶基因的表達，促進脂肪沉積。

在哺乳動物及其細胞系中，叉頭轉錄因子O亞家族1（forkhead?transcription?factor?group?O1，FoxO1）是前體脂肪細胞分化過程的重要調控因子，通過多條通路影響細胞增殖、分化、凋亡。FoxO1可以通過阻礙PPARγ功能復合體與DNA的結合從而抑制PPARγ的轉錄調控活性。在大鼠脂肪組織中研究還發現FoxO1可以抑制PPARγ基因的轉錄，降低PPARγ的表達量。

迄今，關于FoxO1在哺乳動物脂肪代謝中發揮的調節作用的研究已在人、大鼠、小鼠等哺乳動物中開展并取得了許多成果，但尚未見有關FoxO1蛋白用于調節魚類體內脂類代謝平衡的相關研究報道。研究和開發與紅鰭東方鲀FoxO1蛋白相關的基因克隆及其重組表達具有極其重要的作用。

發明內容

本發明的目的是提供一種基于紅鰭東方鲀FoxO1基因的重組蛋白。

同時，本發明還提供一種基于紅鰭東方鲀FoxO1基因的重組蛋白的制備方法。

最后，本發明還提供一種基于紅鰭東方鲀FoxO1基因的重組蛋白在制備調節紅鰭東方鲀脂肪組織PPARγ表達量的藥物組合物或飼料中的應用。

為了實現以上目的，本發明所采用的技術方案是：

一種基于紅鰭東方鲀FoxO1基因的重組蛋白，其含有如SEQ?ID?NO:4所示的氨基酸序列。

所述的氨基酸序列由如SEQ?ID?NO:3所示的核苷酸序列編碼。

一種基于紅鰭東方鲀FoxO1基因的重組蛋白的制備方法，包括以下步驟：

（1）反轉錄PCR（RT-PCR）擴增紅鰭東方鲀脂肪組織總RNA，擴增產物與pGEM-T載體連接得重組質粒，經雙酶切后目的基因再與pET-32a(+)表達載體連接，獲得重組表達質粒；

（2）將重組表達質粒轉化入宿主菌，加入誘導劑IPTG誘導表達FoxO1重組蛋白。

所述的反轉錄PCR擴增的引物對P為：

上游引物P1：5’-CGGAATTCATGGCGGAAGCAGCCCA-3’（見SEQ?ID?NO:1），

下游引物P2：5’-CCGCTCGAGCCCTGACACCCAGCTGTGC-3’（見SEQ?ID?NO:2）。

所述步驟（1）中反轉錄PCR擴增的反應條件為：94℃預變性5min后進行94℃變性40s、61℃復性50s、72℃延伸2min的35個循環的擴增，72℃延伸10min后保存于4℃。

所述步驟（1）中反轉錄PCR擴增的反應體系為：cDNA模版1.0μl、10μM?P11.0μl、10μM?P21.0μl、10×PCR?Buffer?for?KOD-Plus-Neo2.5μl、dNTP?Mixture(各2.5mM)2.0μl、ddH2O17.0μl、1U/μl?KOD-Plus-Neo高保真DNA聚合酶0.5μl，總計25μl。

所述步驟（2）中的宿主菌為大腸桿菌表達菌株Rosetta(DE3)。

所述步驟（2）中取誘導培養后的菌體裂解，離心，取上清液純化即得重組蛋白。