[發明專利]一種高效、低毒的石墨烯多功能載體的構建及其制備方法

在審

• 申請號: 201310729272.0
• 申請日: 2013-12-20
• 公開（公告）號: CN104140981A
• 公開（公告）日: 2014-11-12
• 發明（設計）人: 賈鳳美;劉遵峰;劉倩
• 申請（專利權）人: 常州碳宇納米科技有限公司
• 主分類號: C12N15/87
• 分類號: C12N15/87;C07K1/22
• 代理公司: 無
• 代理人: 無

1.一種用于研究蛋白質作用機制的高效、低毒的石墨烯多功能載體，其特征是可同時實現基因轉染、生物活性分子輸送、蛋白質純化三種功能中的任意兩種或兩種以上功能。

2.根據權利要求1所述的高效、低毒的石墨烯多功能載體，其特征是：以超小尺寸氧化石墨烯為基本載體，超小尺寸的氧化石墨烯尺寸需小于500nm。

3.根據權利要求1所述的高效、低毒的石墨烯多功能載體，其特征是：使用高分子或陽離子高分子提供基因負載和轉染能力，并提供反應性大量官能團NH2。

4.根據權利要求3所述的陽離子高分子包含聚乙烯基亞胺(PEI)、聚酰胺-胺樹形高分子(dendrimer)、脫乙酰殼多糖(chitosan)、陽離子聚磷酸酯、聚乙烯基吡啶鹽、聚(二甲氨基)乙基甲基丙烯酸酯。

5.根據權利要求1所述的高效、低毒的石墨烯多功能載體，其特征是：使用多臂聚乙二醇增加載體的溶解性、生物相容性、延長載體活性成分在細胞內的酶降解半衰期、并減小毒性。

6.根據權利要求1所述的高效、低毒的石墨烯多功能載體，其特征是：使用親和性分離基團可專一性識別其標記的目標蛋白質，提供純化功能。

7.根據權利要求6所述的親和性分離基團包含鏈酶親和素、6倍組氨酸(6XHis)、谷胱甘肽S-轉移酶與谷胱甘肽。

8.根據權利要求1所述的高效、低毒的石墨烯多功能載體，其特征是：可使用牛血清蛋白或雞血清蛋白減少或消除非目標蛋白質的非專一性吸附，提高目標蛋白質純度。

9.根據權利要求1所述的高效、低毒的石墨烯多功能載體的制備，包含以下步驟：

(1)制備權利要求2所述的超小尺寸氧化石墨烯：選取純度99.95％以上的鱗片石墨，根據改進的Hummer’s法制備氧化石墨烯；然后超聲分散于MilliQ水中，使用離心過濾膜過濾，MilliQ水洗滌，得到權利要求2所述的超小尺寸氧化石墨烯(尺寸小于500nm)；

(2)進行陽離子高分子的功能化：將步驟(1)制得的超小尺寸氧化石墨烯分散于MilliQ水中，加入超支化PEI、6臂聚乙二醇、N-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽，室溫攪拌后使用離心過濾膜過濾、MilliQ水洗滌，得到載體1；

(3)進行生物素的功能化：將步驟(2)制得的載體1加入生物素、N-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽，室溫攪拌過夜，使用離心過濾膜過濾，MilliQ水洗滌，得到載體2；

(4)進行功能性多肽的功能化：將步驟(3)制得的載體2加入4-(N-馬來酰亞胺甲基)環己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亞胺酯鈉鹽(Sulfo-SMCC)，溶解在DMSO中，室溫下反應2h；之后使用離心過濾膜過濾，MilliQ水／DMSO混合液洗滌，分散于PBS緩沖液中；加入三羧乙基膦，攪拌反應24h；使用離心過濾膜過濾，PBS緩沖液洗滌，得到載體3；

(5)進行鏈酶親和素的功能化：將步驟(4)制得的載體3在2h內使用蠕動泵緩慢滴加到上述鏈酶親和素與PBS緩沖溶液中，混合；使用離心過濾膜過濾，PBS緩沖液洗滌，分散于PBS緩沖液中，得到載體4；

(6)將步驟(5)制得的載體4加入血清蛋白，溶解于PBS緩沖液中，孵育1h，即完成血清蛋白在該多功能載體上的物理吸附，得到最終的高效、低毒的石墨烯多功能載體。