[發明專利]一種提高植物草銨膦抗性的水稻谷氨酰胺合成酶突變基因及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201310727436.6
• 申請日: 2013-12-25
• 公開（公告）號: CN103757033A
• 公開（公告）日: 2014-04-30
• 發明（設計）人: 趙偉;姚泉洪;彭日荷;薛永;朱波;許晶;高建杰;田永生;付曉燕;金曉芬;韓紅娟;韓靜;王波;王麗娟;李振東
• 申請（專利權）人: 上海市農業科學院
• 主分類號: C12N15/52
• 分類號: C12N15/52;C12N9/00;C12N15/82;C12N15/10;A01H5/00
• 代理公司: 上海開祺知識產權代理有限公司 31114
• 代理人: 費開逵

1.一種提高植物草銨膦抗性的水稻谷氨酰胺合成酶突變基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ?ID?No3所示。

2.根據權利要求1所述的水稻谷氨酰胺合成酶突變基因，其特征在于，其編碼的氨基酸序列如SEQ?ID?No4所示。

3.如權利要求1所述的水稻谷氨酰胺合成酶突變基因的表達載體pYM4807-OsGSM1。

4.一種如權利要求1-3任一項所述的水稻谷氨酰胺合成酶突變基因的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

1)以如SEQ?ID?No1所示的水稻谷氨酰胺合成酶基因序列為模板，合成如所示SEQ?ID?No5～SEQ?ID?No30所示的26條引物，依次命名為引物P1-P26，采用連續延伸PCR法擴增，合成水稻谷氨酰胺合成酶基因，并構建到pBlueScriptII?S+載體，得到含有重組的水稻谷氨酰胺合成酶基因的質粒，具體方法如下：

a)分別以引物P1、P10為外側引物，P2-P9為內側引物合成片斷1；引物P11、P20為外側引物，P12-P19為內側引物合成片斷2；引物P21、P26為外側引物，P22-P25為內側引物合成片斷3；

b)各取1μL片段1、片段2、片段3為模板，用外側引物P1、P26采用連續延伸PCR法擴增得到含有重組的水稻谷氨酰胺合成酶基因；所述反應在50μL反應體系中，內側引物的添加量分別為10ng，外側引物添加量分別為100ng；

c)將擴增得到的含有重組的水稻谷氨酰胺合成酶基因克隆到pBluescriptII?SK+載體中，獲得含有重組的水稻谷氨酰胺合成酶基因的質粒；

2)以前述得到的質粒為模板，以如SEQ?ID?No31和SEQ?ID?No32所示的為引物，采用易錯PCR法對水稻谷氨酰胺合成酶基因進行隨機突變，擴增產物經BamHI和SacI雙酶切后，以正確的閱讀框插入到大腸桿菌表達載體pYM4807中，通過電擊轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，獲得水稻谷氨酰胺合成酶基因的突變文庫；

3)將前述得到的突變文庫轉化到缺陷型菌株JW3841-1，涂布在含有20-100mM草銨膦的培養基上培養，挑取生長正常的單菌落，接種到含氨芐西林的LB液體培養基中培養，初步得到含有草銨膦抗性提高的水稻谷氨酰胺合成酶突變基因的菌樣；

4)將初步得到的菌樣和含有野生型谷氨酰胺合成酶的菌樣稀釋到相同濃度，分別滴加到濃度為0，10mM，20mM，100mM草銨膦的培養基上培養，觀察在不同濃度草銨磷培養基上的生長情況，抽取得到含有所述突變基因的質粒載體，定義為pYM4807-OsGSM1，該質粒經測序得到所述水稻谷氨酰胺合成酶突變基因。

5.權利要求1所述的水稻谷氨酰胺合成酶突變基因在培育抗草銨膦轉基因作物上的應用。