[發明專利]一株抗Bt小菜蛾有活性的蘇云金芽孢桿菌HLJ-66及其應用

有效

• 申請號: 201310726299.4
• 申請日: 2013-12-25
• 公開（公告）號: CN103695362A
• 公開（公告）日: 2014-04-02
• 發明（設計）人: 楊峰山;朱勛;劉春光;張友軍;李柱剛;楊晶;谷有芳;王秀君
• 申請（專利權）人: 黑龍江大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;A01N63/00;A01P7/04;C12R1/07
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標事務所 23109
• 代理人: 侯靜

技術領域

本發明涉及一株對抗Btk小菜蛾有活性的蘇云金芽孢桿菌（Bacillus?thuringiensis）HLJ-66菌株，以及在制備殺蟲劑中的應用。

背景技術

蘇云金芽孢桿菌（Bacillus?thuringiensis,Bt），是土壤中的一種能夠產生芽孢的需氧型革蘭氏陽性細菌。1901年Ishiwate等首次從患病的家蠶(Bombyx?morl)幼蟲當中分離出一種能夠在其芽孢的形成階段，產生晶體蛋白的細菌，1915年Berliner等在地中海粉螟(Epetia?kuhniella)中也成功分離出這種細菌，同時將其命名作蘇云金芽孢桿菌-Bt.thuringiensis。蘇云金芽孢桿菌在其芽孢的形成過程當中，能夠產生一種殺蟲晶體毒素蛋白(Insecticidal?Crystal?Proteins，δ-內毒素)，這種晶體蛋白對鱗翅目(Lepidoptera)昆蟲、同翅目(Homoptera)昆蟲、鞘翅目(Coleoptera)昆蟲、雙翅目(Diptera)昆蟲、膜翅目(Hymenoptera)昆蟲、直翅目(Orthoptera)昆蟲等多個目的昆蟲，同時包括對原生動物、螨類以及線蟲等都具有特異性地殺蟲活性，由于這種晶體蛋白對害蟲高效、對非靶標生物安全以及對環境友好，因此在整個世界范圍內得到了廣泛的應用。該菌菌劑作為噴灑型殺蟲劑主要成分的使用時間已經超過50年，是目前世界上用途最廣、產量最大的微生物殺蟲劑，占微生物殺蟲劑總量的90%-95%。

蘇云金芽孢桿菌的不同殺蟲毒素由不同種類的cry基因控制，各種cry基因已經被成功克隆，并根據不同需要，利用轉基因技術轉入到不同作物中，用于害蟲等有害生物的防治。自1996年轉Btcry基因作物的種植開始，轉Bt基因作物在世界范圍內被廣泛種植，種植面積逐年增長。據2008年的統計顯示，轉Bt基因作物的種植面積已增長至4,600萬公頃。

但隨著其長期使用及轉Bt作物的迅速推廣，害蟲對Bt毒素的抗性已成為不容忽視的問題。隨著Bt毒素的大量長期使用以及轉Bt作物的廣泛種植，昆蟲長期處于選擇壓之下，從而導致了昆蟲都Bt的抗性發展。通過室內篩選，發現許多昆蟲對Bt毒素產生了抗性，例如印度谷螟Plodia?interpunctella、煙蚜夜蛾Heliothis?virescens、小菜蛾Plutella?xylostella、甜菜夜蛾Spodoptera?exigua、歐洲玉米螟Ostrinia?nubilalis、棉紅鈴蟲Pectinophora?gossypiella、棉鈴蟲Helicoverpa?armigera。1990年，Tabashnik等報道田間小菜蛾對Bt制劑產生了抗性，這是第一例關于害蟲在田間對Bt制劑產生抗性的報道；Janmaat等于2003年報道，加拿大不列顛哥倫比亞商業化大棚里的粉紋夜蛾對Bt制劑Dipel和Abbott產生了抗性。Tabashnik等于1989年檢測到田間種群對Bt制劑（kurstaki亞種）產生了25倍的抗藥性，首次報道了田間小菜蛾對Bt殺蟲劑產生了抗藥性。Tang等測定弗羅里達州田間小菜蛾對Bt制劑（BtKNRD12）的抗藥性大于1500倍。Wright等報道馬來西亞田間小菜蛾種群在室內篩選飼養7代后對BtA和BtK制劑的抗藥性分別為330倍和160倍。此外，日本、中美洲、墨西哥和印度等國家和地區也有抗Bt小菜蛾的報道。2000年Zhao等報道從美國南卡羅尼那州田間采集的對Cry1C有31倍抗性的小菜蛾抗性品系，在實驗室先用Cry1C原毒素繼續汰選，然后用表達高劑量的Cry1C毒素的轉基因花椰菜汰選，26代后，該品系對Cry1C毒素抗性高達63100倍（2齡幼蟲）。國內，馮夏等報道深圳、東莞地區等供港菜區小菜蛾對Bt的抗藥性為17.2-30.2倍。李建洪等通過對深圳、東莞和廣州菜區的田間小菜蛾種群檢測，發現小菜蛾對蘇云金芽孢桿菌標準品Cs3ab-1991的抗藥性倍數分別為8.9、6.5、2.1倍。周程愛等報道長沙地區的小菜蛾對Bt的抗藥性由1997-1999年的敏感性由1.1-4.1倍發展到2000年的6.2倍的低水平抗藥性。余德億等報道福建地區田間種群的小菜蛾對湖北Bt和福建Bt的抗藥性分別由1997年的2.1倍和3.1倍上升到1999年的8.2倍和10.1倍。郭世儉等報道浙江省杭州、蕭山、金華、溫州四地的小菜蛾對Bt制劑還沒有產生抗藥性。王崇利等報道廣東惠州田間小菜蛾種群對Cry1Ab和Cry1Ac的抗性達到了高抗水平；對Btk制劑的抗性達到了中抗水平；對Cry1Aa和Cry2Aa具有低水平抗性；福建福州、浙江杭州和江蘇南京田間小菜蛾種群對Cry1Ab、Cry1Ac具有低至中等水平抗性（8-28倍），對Btk制劑具有低水平抗性（3.5-7倍）。