[發(fā)明專利]一株雞新城疫病毒株H12株及其在制備雞新城疫弱毒活疫苗中的應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310726202.X
• 申請日: 2013-12-25
• 公開（公告）號: CN103710313A
• 公開（公告）日: 2014-04-09
• 發(fā)明（設計）人: 張楊;楊萬秋;楊朋欣;李東偉;焦利紅;叢秋實;柴華;張明波;李靜;梁宛楠;胡瑞鴻;劉洪斌
• 申請（專利權(quán)）人: 哈藥集團生物疫苗有限公司
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;A61K39/17;A61P31/14;C12R1/93
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識產(chǎn)權(quán)代理有限責任公司 11139
• 代理人: 孫皓晨;費碧華

技術(shù)領域

本發(fā)明涉及一株雞新城疫病毒株及其應用，具體涉及雞新城疫病毒株H12株及其在制備預防或治療雞新城疫生物制劑中的應用，屬于生物技術(shù)領域。

背景技術(shù)

新城疫（newcastle?disease，ND）是由新城疫病毒（Newcastle?disease?virus，NDV）引起的一種急性、高度接觸性禽類傳染病，是當今全球范圍內(nèi)重要的家禽傳染病之一。在臨床上該病常呈敗血癥經(jīng)過，主要特征是呼吸困難、下痢、神經(jīng)機能紊亂、黏膜和漿膜出血。該病發(fā)病急、致死率高，對養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展構(gòu)成了嚴重威脅，因此被世界動物衛(wèi)生組織（OIE）定為A類傳染病，我國也將其列為一類動物疫病。

目前，該病已廣泛流行于我國所有養(yǎng)雞地區(qū)，在家禽病毒病中，它的流行和危害性占首位。據(jù)農(nóng)業(yè)部估計，我國每年因各種禽病造成的經(jīng)濟損失高達數(shù)十億元，其中NDV占了近10%。

NDV只有1個血清型，但根據(jù)其毒力的不同，可以分為強毒株、中等毒力株和弱毒株（低致病力毒株）。強毒株又可稱為速發(fā)型毒株，中等毒力株為中發(fā)型毒株，弱毒株為緩發(fā)型毒株。

盡管我國新城疫免疫接種已經(jīng)普及多年并己基本上控制了典型新城疫的流行，但非典型ND仍時有發(fā)生，嚴重威脅著養(yǎng)雞業(yè)的健康發(fā)展。目前疫苗是控制本病發(fā)生的重要手段。

自從1940開始，就在全球范圍內(nèi)使用新城疫疫苗，最為成功的疫苗是由緩發(fā)型病毒株和經(jīng)過精心篩選的某些中發(fā)型病毒株組成的新城疫活病毒疫苗。

在我國，使用弱毒活疫苗和油乳劑滅活疫苗已成為防治新城疫的常規(guī)實踐。

滅活苗自70年開始應用，分單純滅活苗和油乳劑滅活苗，目前應用較多的是油乳劑滅活苗。油乳劑滅活苗可以產(chǎn)生堅強而持久的免疫力，不會通過疫苗的使用而擴散病原。

弱毒疫苗株包括中等毒力的I系疫苗（Mukteswar株）以及弱毒的Ⅱ系、Ⅲ系、Ⅳ系和V4弱毒疫苗。

最近幾年，隨著細胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，細胞苗和克隆苗相繼問世?？寺∶缇哂锌乖约円唬庖咴詮姷奶攸c。我國從美國引進的克隆N-79株型La?Sota弱毒株，從I系中挑選出的克隆-30及克隆-83是具有良好免疫原性而且遺傳性非常穩(wěn)定的弱毒疫苗。

細胞苗具有成本低、容易生產(chǎn)和可避免雞源性潛在疾病感染的特點。

成纖維細胞是結(jié)締組織最主要的細胞成分，它是由胚胎時期的間充質(zhì)細胞分化而來，在分泌細胞外基質(zhì)成分和構(gòu)建細胞外基質(zhì)中扮演著十分重要的角色，在組織創(chuàng)傷修復過程中也發(fā)揮著重要的作用。由于雞胚成纖維細胞相對容易獲得，而且增殖能力強，適應性強，具有良好的耐受性，性狀比較穩(wěn)定，不易發(fā)生轉(zhuǎn)化。因此，使得成纖維細胞除了應用于細胞和分子生物學的研究，還被廣泛應用于病毒學研究領域，同時也是疫苗生產(chǎn)的重要細胞資源。

但目前市售的雞新城疫活疫苗絕大部分來源于雞胚組織苗，因為利用現(xiàn)有的雞胚成纖維細胞生產(chǎn)工藝所生產(chǎn)的原液，病毒滴度不穩(wěn)定，批間差異較大。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題之一是提供一種低致病力的雞新城疫病毒，該病毒具有免疫原性好，安全，且同時具有在細胞上增殖的特性，從而適宜作為大規(guī)模生產(chǎn)弱毒疫苗的種毒。

為了達到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)手段：

2012年，本發(fā)明發(fā)明人從黑龍江省齊齊哈爾市郊某養(yǎng)殖場，采集瀕死雞肝臟，研磨后用2000單位青、鏈霉素溶液處理，再接種雞胚，收集48h～96h雞胚尿囊液，分離了一株低致病力的雞新城疫病毒，其具有在細胞上增殖的特性。基于此，本發(fā)明通過利用病毒馴化與純化技術(shù)，篩選出了在雞胚成纖維細胞上增殖力良好的低致病力的病毒株，研究表明該病毒株具有滴度高、免疫原性好、安全性好等優(yōu)點。

本發(fā)明分離得到低致病力的雞新城疫病毒，命名為H12株，分類命名為雞新城疫病毒，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏地址：北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學院微生物研究所，微生物保藏號為CGMCC?No.8506；保藏日期：2013年11月18日。

本發(fā)明還提出了所述的低致病力的雞新城疫病毒在制備雞新城疫弱毒活疫苗中的應用。

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題之二是提供一種制備雞新城疫弱毒活疫苗的方法。

為了達到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)手段：

一種制備雞新城疫弱毒活疫苗的方法，其特征在于包括以下步驟：

（1）將保藏號為CGMCC?No.8506的H12株用無血清DMEM稀釋10⁴倍后，接種單層雞胚成纖維細胞，至37℃培養(yǎng)，當細胞80%出現(xiàn)病變時，至-20℃凍融3次后，收獲用于疫苗制備.