[發明專利]一種提高蕎麥細胞同步化的蕎麥細胞培養方法

有效

• 申請號: 201310724777.8
• 申請日: 2013-12-24
• 公開（公告）號: CN103695365A
• 公開（公告）日: 2014-04-02
• 發明（設計）人: 王躍華;趙鋼;宋超;孫雁霞;劉銀花;唐川;龔婷;謝玨;黃菲;江明殊;李睿玉;許志強;徐恩琴;梅英;唐鳳如
• 申請（專利權）人: 成都大學
• 主分類號: C12N5/04
• 分類號: C12N5/04
• 代理公司: 成都科奧專利事務所(普通合伙) 51101
• 代理人: 王蔚

技術領域

本發明涉及一種蕎麥細胞的培養方法，特別是涉及一種提高蕎麥細胞同步化的蕎麥細胞培養方法。

背景技術

蕎麥(Fagopyrum?esculentum)是蓼科(Polygonaceae)蕎麥屬(Fagopyrum?Mill.)的雙子葉作物，有苦蕎和甜蕎兩種，是一種藥食同源的植物?？嗍w其籽粒、根、莖、葉及花等多種器官中都含有大量黃酮類物質，蕎麥中的生物類黃酮物質具有調節毛細血管的通透性和脆性、調節血脂、調節血壓、抗血栓等方面的作用。

目前，利用植物細胞原生質體融合技術是獲得植物同源和異源多倍體的重要途徑之一，該技術不僅能克服遠源雜交不親和的障礙，還能克服通過有性雜交誘導多倍體植物的麻煩，可有效地實現將目的基因導入到栽培植物中去，從而可獲得具有多種優良性狀的栽培植物新品種。但如果進行融合的兩個親本細胞是處于不同的細胞分裂時期，常常會造成原生質體不易產生融合體。另一方面，在利用細胞培養方法生產細胞次生代謝物的過程中，通過采取添加適宜的誘導子可顯著提高培養細胞中的次生代謝物的合成；目前研究表明，處于不同分裂時期的細胞，對其添加的誘導子敏感性不同，因此在利用細胞培養方法生產其次生代謝物的過程中，需采用將培養的細胞調整到特定的細胞分裂期，再實施誘導子的添加，不僅可有效地提高對誘導子的使用效率，還可明顯地促進培養細胞中的次生代謝物的合成。

發明內容

本發明的目的在于提供一種可提高蕎麥細胞同步化的蕎麥細胞的培養方法。

本發明提供的提高蕎麥細胞同步化的蕎麥細胞培養方法包括如下步驟：

（1）蕎麥愈傷組織細胞的預處理：選取產生15～25天、生長良好的蕎麥愈傷組織，以10～25g/L的接種量接入改良的Nitsch+2,4-D1.0～3.0mg/L+水解絡蛋白50～150mg/L+谷氨酰胺100～500mg/L的液體培養基中進行懸浮培養，每培養25天繼代一次，連續繼代2～4次，懸浮培養的條件為：搖床轉速120～140r/min、溫度20～28℃、每天光照6～10小時和光照強度為500～800lx，所述改良Nitsch培養基是指肌醇濃度為150～300mg/L的Nitsch培養基；

（2）蕎麥細胞同步化的誘導：將步驟（1）培養的蕎麥懸浮細胞接入1/2～1/4MS+2,4-D1.0～3.0mg/L+6-BA0.1～0.3mg/L+L+蔗糖50～100g/L+矮壯素0.5～1.0mg/L的液體培養基中，在溫度為1～3℃、搖床轉速為60～100r/min和無光照的條件下振蕩培養12～24h，然后再轉接到1/2MS+NAA0.5～2.0mg/L+6-BA0.1～0.3mg/L+蔗糖10～50g/L+甘露醇1～3g/L的培養基中，在5～10℃、無光照和搖床轉速為60～100r/min的條件下振蕩培養18～24h，最后轉接到B5+NAA1.0～3.0mg/L+6-BA0.1～0.3mg/L+蔗糖20～40g/L的培養基中，在20～25℃、無光照和搖床轉速為60～100r/min的條件下振蕩培養24～48h，將培養的細胞用顯微觀察并計算出細胞的分裂指數。

（3）細胞分裂指數的測定：取步驟（2）中培養的細胞，用滴管反復吹打混勻后，滴在冷凍干燥后的載玻片上，用改良的席夫式染液染色，并經顯微觀察計算出細胞的分裂指數。

上述蕎麥愈傷組織的誘導培養步驟是：選取當年收獲的蕎麥種子，去掉種皮后放在超凈工作臺上，先用0.1%的升汞消毒3～5min，然后用無菌水沖洗5次后接種于MS+2,4-D1.0～4.0mg/L+KT0.5～2.0mg/L+瓊脂5.5～7.5g/L+蔗糖25～35g/L的愈傷組織培養基中，在溫度25±3℃、每天光照6～10小時、光照強度為800～1200lx的條件下誘導培養蕎麥愈傷組織。

本發明采用先對蕎麥愈傷組織細胞進行預處理，再將預處理后的蕎麥愈傷組織細胞接入不同的培養基中，在不同的培養條件下進行多環節的同步化誘導處理，可使處于不同分裂時期的細胞調整到特定的細胞分裂期，從而可有效促進培養細胞中次生代謝物的合成。

下面結合實施例對本發明作進一步詳細說明。

具體實施方式

實施例1

（1）蕎麥愈傷組織的誘導培養：選取當年收獲的蕎麥種子，去掉種皮后放在超凈工作臺上，先用0.1%的升汞消毒3min，然后用無菌水沖洗5次后，接種于MS+2,4-D1.0mg/L+KT0.5mg/L+瓊脂5.5g/L+蔗糖25g/L的愈傷組織培養基中，在溫度22℃、每天光照6小時、光照強度為800lx的條件下培養，獲得蕎麥愈傷組織；