[發(fā)明專利]一種高效提取厭氧顆粒污泥微生物總RNA的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310724606.5
• 申請日: 2013-12-24
• 公開（公告）號: CN103695414A
• 公開（公告）日: 2014-04-02
• 發(fā)明（設計）人: 姬丹丹;臧立華;薛嶸;李肖玲
• 申請（專利權(quán)）人: 齊魯工業(yè)大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 濟南圣達知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 37221
• 代理人: 李健康

1.一種提取厭氧顆粒污泥微生物總RNA的方法，包括下列步驟：

1）取活性污泥于滅菌離心管中離心；

2）棄上清，然后向離心管內(nèi)加入滅菌玻璃珠和貯存液Ⅰ，將離心管管蓋擰緊后置于旋渦混合器擊打3～8min以解絮凝并洗滌污泥除去腐殖酸，離心；

3）棄上清，重復步驟2）處理1次后，用磷酸鹽緩沖液PBS洗滌污泥1次；

4）取步驟3）預處理后的污泥，加入貯存液Ⅱ于30～40℃溫育5～15min；

5）加入TRIzol，漩渦振蕩3～8min后，離心；

6）取上清，加入氯仿，漩渦振蕩10～20s后，室溫放置1～4min并離心；

7）取上清，加入異丙醇，－20℃放置15～25min，離心；

8）棄上清，加入75％乙醇洗滌沉淀后，9000～11000r/min離心3～8min；

9）棄上清，風干沉淀，用貯存液Ⅲ溶解核酸沉淀后，加入DNase?I(RNase?free)25～35U和RNase抑制劑35～40U，并于30～40℃作用10～20min，進一步采用RNA純化試劑盒純化RNA。

2.如權(quán)利要求1所述的提取厭氧顆粒污泥微生物總RNA的方法，其特征在于，步驟1）和2）所述離心為，7000～9000r/min，3～8℃條件下離心3～8min。

3.如權(quán)利要求1所述的提取厭氧顆粒污泥微生物總RNA的方法，其特征在于，步驟2）所述滅菌玻璃珠的直徑為2～3mm，滅菌玻璃珠的加入量為0.2～0.4g/ml活性污泥；貯存液Ⅰ的加入量為1～2mL/ml活性污泥。

4.如權(quán)利要求1所述的提取厭氧顆粒污泥微生物總RNA的方法，其特征在于，步驟3）中，將離心管管蓋擰緊后置于旋渦混合器擊打5min以解絮凝并洗滌污泥除去腐殖酸，步驟4）中貯存液Ⅱ的加入量為100μL/100μL預處理后的污泥；步驟4）中于37℃溫育10min。

5.如權(quán)利要求1所述的提取厭氧顆粒污泥微生物總RNA的方法，其特征在于，步驟5）所述的TRIzol加入量為0.5～1.5mL/100μL預處理后的污泥。

6.如權(quán)利要求1所述的提取厭氧顆粒污泥微生物總RNA的方法，其特征在于，步驟5）、6）和7）所述的離心為9000～11000r/min離心8～12min。

7.如權(quán)利要求1所述的提取厭氧顆粒污泥微生物總RNA的方法，其特征在于，步驟6）中，氯仿加入量為150～240μL/100μL預處理后的污泥；

步驟7）中，異丙醇加入量為150～240μL/100μL預處理后的污泥；

步驟8）中10000r/min離心5min。

8.如權(quán)利要求1所述的提取厭氧顆粒污泥微生物總RNA的方法，其特征在于，步驟9）中貯存液Ⅲ的加入量為20～40μL/100μL預處理后的污泥。

9.如權(quán)利要求1所述的提取厭氧顆粒污泥微生物總RNA的方法，其特征在于，步驟9）中加入DNase?I(RNase?free)30U和RNase抑制劑40U，并于37℃作用15min。

10.如權(quán)利要求1所述的提取厭氧顆粒污泥微生物總RNA的方法，其特征在于，所有耗材都要經(jīng)過DEPC處理及高壓滅菌。