[發明專利]中國家豬與西方商品豬資源鑒定位點及其位點擴增引物

有效

• 申請號: 201310723082.8
• 申請日: 2013-12-25
• 公開（公告）號: CN103789411A
• 公開（公告）日: 2014-05-14
• 發明（設計）人: 張亞平;謝海兵;韓徐曼
• 申請（專利權）人: 中國科學院昆明動物研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 昆明今威專利商標代理有限公司 53115
• 代理人: 楊宏珍

技術領域：

本發明提供一種中國家豬與西方商品豬資源鑒定位點及其位點擴增引物，屬于生物技術領域。

背景技術：

本發明基于全基因組重測序數據，與傳統的單一基因，如MC1R基因以及AFLP等鑒別技術相比，本發明所給出的分子標記位點更加全面地代表了中國家豬品種中受到選擇的經濟性狀連鎖區域。解決了現如今中國多個家豬品種種質資源混亂，難以排除西方商品豬血緣的尷尬局面。11個分子標記位點位于7條不同的染色體上，較單一基因的檢測效力更可信。與傳統鑒定技術微衛星相比較，微衛星標記技術雖然得到了較廣泛的應用，但其隨機分布在遺傳圖譜上，不能直接與中國家豬品種所特有分子遺傳組分相關聯。

發明內容：

本發明的目的是提供一種中國家豬與西方商品豬資源鑒定位點及其其位點擴增引物，為中國家豬的育種及種質資源保護過程中種質的鑒定提供準確指導。

本發明篩選中國家豬遺傳組分中特有的單核苷酸標記位點，通過現代分子生物學技術檢測這11個分子標記位點的基因型，用于有效地鑒定并區分中國家豬品種與西方商品豬血緣。

本發明的技術方案主要包括:豬DNA的提取，用Illumina二代測序技術進行全基因組重測序，在全基因組分析的基礎上篩選分子標記并進行擴大群體驗證。使用本方法對所要鑒定的個體進行基因分型，在本發明的11個單核苷酸標記位點上，不同的基因型被認為是家豬、西方商品豬2個群體分別特有的，依此來判斷該個體屬于哪一群體。11個分子標記位點的坐標如下（基因組版本：NCBI?Build?Sscrofa10.2）。chr4_90338649、chr6_46031147、chr3_40173091、chr1_304503930、chr8_55949794、chr4_51135766、chr14_51320355、chr6_261199、chr1_82559795、chr15_101338073、chr4_81507260，11個位點中國家豬的優勢等位基因分別是G、T、A、T、A、C、A、C、A、T、G。

用于中國家豬與西方商品豬資源鑒定位點擴增的引物如表1。

表1引物序列表

本發明實現的方法如下：

1、全基因組測序

本發明首先利用群體遺傳學統計方法分析了5個中國家豬品種（51個個體）與1個杜洛克個體全基因組數據，最終在全基因組水平上篩選到11個單核苷酸分子標記位點。

2、擴大群體驗證

選擇了12個中國家豬品種（34個個體）與大白、長白、杜洛克豬共22個個體對11個分子標記進行基因分型。首先在豬的樣品中擴增含有11個分子標記位點的核苷酸多態位點的片段,并對擴增到的DNA片段中的11個核苷酸多態位點進行測序。基因分型結果，10個分子標記在中國家豬與中國西方商品豬群體間基因型頻率分化極顯著（卡方檢驗）。1個分子標記在中國家豬與西方商品豬群體間基因型頻率分化顯著，見表2。卡方檢驗充分證明利用這11個單核苷酸分子標記位點能高效、準確的區分中國家豬與西方商品豬的種質資源。

3、分型技術SNaPshot

本發明順應現代生物技術的發展，利用群體遺傳學統計量對全基因組重測序數據進行了分析。在全基因組的水平上，提出一種新的種質資源鑒定與保護的新方法。

本發明的有益效果在于：篩選中國家豬遺傳組分中特有的單核苷酸標記位點，通過現代分子生物學技術檢測分子標記位點的基因型，用于有效地鑒定并區分中國家豬品種與西方商品豬血緣。為中國家豬的育種及種質資源保護過程中種質的鑒定提供準確指導。

具體實施方案：

A、根據Ensembl數據庫豬基因組序列，使用Primer?premier5軟件，設計引物對。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。引物序列及擴增產物片段大小見表1。

B、樣本采集

采集了12個中國家豬品種（34個個體）、大白、長白、杜洛克豬共22個個體的肌肉組織或者血液。

C、樣品基因組提取

1)取150μl或200μl全血(或約30mg的組織，用剪刀剪成糊狀)。

2)加入450μl或550μl?STE緩沖液(30mM?Tris-HCL,200mM?EDTA,50mM?NaCl,pH8.0)和終濃度分別為10％的SDS75μl和200mg/ml的蛋白酶K50μl。

3)充分混勻后置57℃溫箱中消化8－12小時至澄清,其間搖勻數次。