[發(fā)明專利]一種胞外丙酮酸產(chǎn)量提高的基因工程菌及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310722490.1
• 申請日: 2013-12-24
• 公開（公告）號: CN103710274A
• 公開（公告）日: 2014-04-09
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳堅;郭洪偉;周景文;堵國成
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號: C12N1/16
• 分類號: C12N1/16;C12N15/81;C12P7/50;C12R1/88
• 代理公司: 北京愛普納杰專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 11419
• 代理人: 何自剛;王玉松

1.一種胞外丙酮酸產(chǎn)量提高的基因工程菌，其特征在于，在光滑球擬酵母(Torulopsis?glabrata)CCTCC?M202019中過量異源表達(dá)編碼抗逆性蛋白CutA的基因。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述編碼抗逆性蛋白CutA的基因核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。

3.構(gòu)建權(quán)利要求1或2所述的基因工程菌的具體包括以下步驟：

(1)獲得外源目的基因：對已知的掘越氏熱球菌(Pyrococcus?horikoshii)抗逆性蛋白CutA核苷酸序列（SEQ?ID?NO.1），進(jìn)行優(yōu)化獲得SEQ?ID?NO.2所示序列；

(2)構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒：全化學(xué)合成步驟1）中的SEQ?ID?NO.2，并克隆至多拷貝表達(dá)載體pRS306TEF1中的Bam?HI-Eco?RI插入位點，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pRS306TEF1-CutA；

(3)獲得基因工程菌：利用電穿孔轉(zhuǎn)化方法將被分離純化的重組質(zhì)粒pRS306TEF1-CutA轉(zhuǎn)化T.glabrata?CCTCC?M202019△ura3，在YNB培養(yǎng)基平板中篩選原養(yǎng)型細(xì)胞。

4.權(quán)利要求1或2所述基因工程菌的方法，具體包括以下步驟：

(1)獲得外源目的基因：對已知的掘越氏熱球菌(Pyrococcus?horikoshii)抗逆性蛋白CutA核苷酸序列進(jìn)行優(yōu)化獲得SEQ?ID?NO.2所示序列；

(2)構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒：全化學(xué)合成步驟1）中的SEQ?ID?NO.2所示序列，并克隆至多拷貝表達(dá)載體pRS306TEF1中的Bam?HI-Eco?RI插入位點，并獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pRS306TEF1-CutA；化學(xué)合成釀酒酵母(Saccharomyces?cerevisae)熱擊蛋白HSP150編碼基因的啟動子序列，克隆至pRS306TEF1-CutA質(zhì)粒上的Sac?I-Xho?I插入位點，替換pRS306TEF1-CutA質(zhì)粒上的組成型啟動子TEF1為溫度誘導(dǎo)型啟動子，并獲得pRS306HSP150-CutA質(zhì)粒；

(3)獲得基因工程菌：利用電穿孔轉(zhuǎn)化方法將被分離純化的重組質(zhì)粒pRS306HSP150-CutA質(zhì)粒轉(zhuǎn)化T.glabrata?CCTCC?M202019△ura3，在YNB培養(yǎng)基平板中篩選原養(yǎng)型細(xì)胞。

5.應(yīng)用權(quán)利要求1或2所述的基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)丙酮酸的方法，其特征在于，將所得基因工程菌分布至含有種子培養(yǎng)基的斜面培養(yǎng)基上，并將新鮮培養(yǎng)的斜面培養(yǎng)物接種至含有25mL種子培養(yǎng)基的250mL三角搖瓶中，28℃、200rpmin，培養(yǎng)24小時；按10%(v/v)的接種量接入3L發(fā)酵罐中，發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量為1.5L，發(fā)酵罐培養(yǎng)條件為通氣量4vvm，攪拌轉(zhuǎn)速400r/min，溫度30℃，pH值和溶氧通過自動流加泵流加濃度為8mol·L^-1NaOH和2mol·L^-1HCl濃度的溶液維持培養(yǎng)基pH控制在穩(wěn)定范圍內(nèi)。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述種子培養(yǎng)基成分為：葡萄糖20g·L^-1，蛋白胨10g·L^-1，MgSO₄·7H₂O0.5g·L^-1，KH₂PO₄1g·L^-1，調(diào)pH為5.5。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)基成分為：葡萄糖100g·L^-1，NH₄Cl7g·L^-1，KH₂PO₄5g·L^-1，MgSO₄·7H₂O0.8g·L^-1，乙酸鈉6g·L^-1，煙酸4m?g·L^-1，鹽酸硫胺素30μg·L^-1，煙酸吡哆醇100μg·L^-1，生物素10μg·L^-1，核黃素50μg·L^-1。培養(yǎng)基初始pH5.0。維生素液過濾除菌后加入。