[發(fā)明專利]銪螯合物乳膠時間分辨熒光免疫層析定量檢測食品中β-受體激動劑試劑

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310722190.3
• 申請日: 2013-12-24
• 公開（公告）號: CN104090248A
• 公開（公告）日: 2014-10-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王學(xué)生;杜森垚;黃華;胡小龍
• 申請（專利權(quán)）人: 上海容暉生物科技有限公司
• 主分類號: G01R33/02
• 分類號: G01R33/02;G01N21/64;G01N33/558;G01N33/577
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明應(yīng)用免疫學(xué)原理，在包有銪螯合物的乳膠顆粒上標記特異性抗體，通過免疫層析技術(shù)和相應(yīng)包被抗原的免疫反應(yīng)，再借助于時間分辨熒光儀達到定量檢測低濃度β-受體激動劑，應(yīng)用于快速定量檢測食品和飼料中β-受體激動劑及獸藥殘留。

背景技術(shù)

食品安全日益受到人們重視，尤其通過2011年“3.15事件”畜牧業(yè)上非法添加瘦肉精的暴光，以及近年來食品安全事故頻發(fā)，例豬肉的瘦肉精中毒、三聚氰胺的毒奶粉、孔雀石綠的致癌魚等等，使我國的食品安全成了全球關(guān)注焦點。

我國雖然加強對“瘦肉精”類的β-受體激動劑監(jiān)控力度，嚴厲打擊生豬養(yǎng)殖業(yè)非法添加，但一些不法分子在黑心利益驅(qū)動下逃避政府監(jiān)控，仍使用“瘦肉精”或類似物。故加強政府監(jiān)控同時，不斷提高檢測方法，來震懾那些不法之徒，保障百姓的食品安全。

目前，檢測瘦肉精類的β-受體激動劑殘留方法，主要有儀器分析，例高效液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法；酶聯(lián)免疫吸附分析法；膠體金快速定性檢測和熒光檢測法。儀器分析法需要昂貴的儀器設(shè)備、專業(yè)化的實驗室和訓(xùn)練有素的專業(yè)人才，且對樣品前處理要求高、過程復(fù)雜、速度慢等缺點。酶聯(lián)免疫吸附分析技術(shù)具有靈敏度高、分析成本低特點，但耗時也需專業(yè)人員和實驗室，不適合現(xiàn)場篩選。膠體金層析和免疫熒光層析法，特點快速簡便，適合現(xiàn)場快速篩選檢測，由于膠體金檢測是通過肉眼判別結(jié)果，對檢測限量低的項目，例1ppb以下或不得檢出的項目，目前技術(shù)很難實現(xiàn)。另外，膠體金微粒在不同介質(zhì)呈色略微差異，這樣依顏色深淺來定量就很難了，由于這些缺陷限止它的縱向發(fā)展。熒光檢測原理和膠體金法類似，靈敏度比膠體金高，由于試劑組成中的硝酸纖維素膜和檢測的樣品背景(例尿樣、組織樣等均含有蛋白、糖類物質(zhì)，這些物質(zhì)具有熒光效應(yīng))干擾，影響檢測結(jié)果的準確性，尤其對檢測限量低的項目這種噪信號干擾尤為突出，加上此法需配儀器，目前應(yīng)用面遠不如膠體金廣。

既要達到膠體金法快速簡便又實現(xiàn)高靈敏且定量檢測的方法，這是人們翹首以盼的，上世紀80-90年代Pettersson，Eskola首先報告了時間分辨免疫分析法(time-resolved?fluoroimmunoassay，TRFIA)在測定人絨毛膜促性腺激素臨床醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用，經(jīng)過幾十年努力TRFIA在臨床醫(yī)學(xué)得到快速發(fā)展和應(yīng)用。但農(nóng)業(yè)領(lǐng)域應(yīng)用TRFIA檢測剛剛起步，尤其是對小分子檢測例食品中獸藥殘留、抗生素殘留檢測更少。與傳統(tǒng)發(fā)光技術(shù)相比，時間分辨熒光一般采用鑭系元素中Eu³⁺螯合物，此螯合物激發(fā)光波長300-340nm，而發(fā)射光波長613nm，stokes位移300nm左右，而且熒光的半衰期1×10³-1×10⁶ns，而一般蛋白熒光半衰期(1-10ns)，所以半衰期是一般蛋白熒光半衰期的5-6個數(shù)量級長，這樣激發(fā)光后，稍延遲一般樣品和材料的熒光已衰變完全，此后再采集熒光信號只是Eu³⁺螯合物特異物發(fā)出的熒光，由此TRFIA檢測技術(shù)具有較高的信噪比，具有較高的檢測靈敏度原因，時間分辨熒光免疫分析法的檢測靈敏度比傳統(tǒng)發(fā)光檢測方法高2到3個數(shù)量級，由于熒光由激發(fā)后銪螯合物產(chǎn)生的，這種熒光不隨樣品形式和時間變化而影響，所以從理論上實現(xiàn)定量檢測。本發(fā)明在包有Eu³⁺螯合物乳膠上標記特異性抗體，在硝酸纖維素膜上包被相應(yīng)抗原，這兩者結(jié)合組成試劑，檢測過程由TRFIA儀采集信號實現(xiàn)檢測結(jié)果。

發(fā)明內(nèi)容

銪螯合物乳膠時間分辨熒光免疫層析定量檢測食品中β-受體激動劑試劑，是一種在Eu³⁺螯合物乳膠上標記特異性抗體，在硝酸纖素膜上包被相應(yīng)抗原，由這兩者結(jié)合組成的測試試劑。此試劑的特點：快速、準確、簡便、靈敏和定量。本發(fā)明目的為快速準確檢測食品中的β-受體激動劑及其他獸藥殘留和超敏要求的檢測物——例抗生素、真菌毒素等——提供更有效手段，同時彌補膠體金法靈敏度低及不能定量的缺陷。

本發(fā)明通過以下方案實現(xiàn)：1、包有稀土元素Eu³⁺螯合物的熒光乳膠顆粒(Thermo?Fisher)上標記β-受體激動劑類小分子的特異性單抗，例鹽酸克侖特羅(Clenbuterol)抗體(俗稱瘦肉精)、萊克多巴胺(Ractopamine)抗體等，標記的熒光乳膠包被于400ul或300ul的微孔容器中抽干或凍干。

2、在硝酸纖維素膜(Millipore)的檢測區(qū)和對照區(qū)上分別包被β-受體激動劑類的完全抗原(例Clen-BSA、Rac-BSA)和羊抗鼠IgG。