[發明專利]一種生產檸檬酸的菌株及其發酵制備檸檬酸的方法

有效

• 申請號: 201310721972.5
• 申請日: 2013-12-23
• 公開（公告）號: CN103695319A
• 公開（公告）日: 2014-04-02
• 發明（設計）人: 李榮杰;尚海濤;楊為華;鄧遠德;徐斌;穆曉玲;李維理;紀傳俠
• 申請（專利權）人: 安徽豐原發酵技術工程研究有限公司
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12P7/48;C12R1/685
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君

1.一種生產檸檬酸的菌株，其特征在于，其分類命名為黑曲霉（Aspergillus?niger），已于2013年10月18日保藏于中國典型培養物保藏中心CCTCC，保藏編號：CGMCC?No.8368。

2.一種權利要求1所述菌株的獲取方法，其特征在于，具體步驟如下：

（1）菌種分離純化：以黑曲霉（Aspergillus?niger,保藏號CGMCC?NO.6465）作為出發菌株，將其稀釋分離，涂布到平板培養基上，于36℃±1℃培養36～48h；

（2）菌種的擴大培養：將步驟（1）分離純化后的單菌落分別接種于試管斜面培養基，于36℃±1℃培養4～6d；

（3）菌種發酵培養：將步驟（2）中試管斜面培養好的單菌落用接種環勾取1～2環成熟孢子接入發酵搖瓶，于36℃±1℃，搖床轉速300～350rpm/min，培養80～100h;

（4）初篩：將步驟（3）搖瓶發酵液過濾，用NaOH對濾液進行滴定，通過測得發酵液產酸水平，初篩檸檬酸產量高的菌株進行復篩;

（5）復篩：將步驟（4）篩選出的菌株重復步驟（1）～（4）的過程，直至篩選得到產酸量達到14%的菌株。

3.根據權利要求2所述的獲取方法，其特征在于，步驟（1）中所述平板培養基和步驟（2）所述斜面培養基均為PDA土豆培養基，其質量百分數組分為：土豆汁10%～15%、葡萄糖1%～5%、瓊脂1.5%～2.5%，由檸檬酸生產的中和廢水配制。

4.根據權利要求3所述的獲取方法，其特征在于，所述中和廢水為鈣鹽法提取檸檬酸發酵工藝中，檸檬酸發酵液經過板框壓濾進入中和工段進行中和反應后所產生的中和廢水，其中含有：Ca離子200～500ppm、K離子600～1000ppm、Mg離子100～200ppm、Fe離子10～30ppm、Na離子30～60ppm、Zn離子10～30ppm、硫酸根離子200～500ppm、氯離子30～60ppm、NH₄離子10～40ppm，pH為4.5～5.5。

5.根據權利要求2所述的獲取方法，其特征在于，在步驟（3）中，所述發酵培養基是由淀粉質原料調漿至粉漿比15-30%，加入α-淀粉酶，經液化，過濾，以濾液為基料，利用檸檬酸中和廢水配制總糖含量為0.13g/ml～0.18g/ml的培養基。

6.根據權利要求5所述的獲取方法，其特征在于，所述淀粉質原料包括玉米、木薯或高粱中一種或兩種以上。

7.一種權利要求1所述菌株生產檸檬酸的方法，其特征在于，包括步驟如下：

（1）擴大培養：將上述權利要求1-6任一所述菌株接入傳代試管斜面進行第一次擴大培養，培養條件為36℃±1℃，培養時間4～6d；將培養好的斜面孢子接入麩曲瓶進行第二次擴大培養，培養條件為36℃±1℃，培養時間5～8d；

（2）孢子懸液的制備：將步驟（1）培養好的孢子沖洗配成懸浮液，每克麩曲所含孢子數為2×10¹⁰～5×10¹⁰，無菌條件下將孢子懸液倒入鋼瓶備用；

（3）種子罐培養：將步驟（2）中所得到的孢子懸液接入檸檬酸種子罐進行培養，培養條件為：36℃±1℃、通風比為1:0.6～1.2、罐壓0.3～0.6MPa、攪拌轉速100～400rpm/min，培養周期為18～30h；

（4）發酵罐培養：將步驟（3）種子液按接種量5-10%接入發酵罐進行發酵培養，培養條件為：36℃±1℃、通風比為1:0.6～1.2、罐壓0.3～0.6MPa、攪拌轉速80～500rpm/min，培養周期為72～96h。

8.根據權利要求7上述方法，其特征在于，所述種子罐培養基是先將淀粉質原料調漿至粉漿比為15%～30%，加入α-淀粉酶液化，再利用檸檬酸制備過程中的中和廢水配制成培養基；

所述發酵罐培養基是先將淀粉質原料調漿至粉漿比為15%～30%，加入α-淀粉酶液化，經液化，過濾，再以所得濾液為基料，利用檸檬酸制備過程中的中和廢水配制成培養基。

9.根據權利要求8上述方法，其特征在于，所述淀粉質原料選自玉米、木薯或高粱中一種或兩種以上。

10.根據權利要求7上述方法，其特征在于，所述種子罐培養基中總糖含量為0.05～0.1g/mL；發酵罐培養基中總糖含量為0.12～0.20g/mL。