[發(fā)明專(zhuān)利]一種多特異性融合抗體及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310721847.4
• 申請(qǐng)日: 2013-12-24
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104371020B
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-04-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王穎;柳增善;張東杰;安宇;霍方珍
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C07K16/46
• 分類(lèi)號(hào): C07K16/46;C12N15/13;C12N5/10;G01N33/68
• 代理公司: 北京愛(ài)普納杰專(zhuān)利代理事務(wù)所(特殊普通合伙)11419
• 代理人: 何自剛,王玉松

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種多特異性融合抗體，特別是一種能同時(shí)與四種殘留藥物發(fā)生免疫學(xué)反應(yīng)的抗體，屬于免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

傳統(tǒng)的單克隆抗體由于其分子本身F_C龐大結(jié)構(gòu)特點(diǎn)使得其在疾病診斷和治療方面存在許多問(wèn)題：首先，傳統(tǒng)單克隆抗體都是異源性的，誘發(fā)免疫反應(yīng)普遍較強(qiáng)；其次，在體內(nèi)代謝快，特異性稍差；再次，雜交瘤技術(shù)篩選的單克隆抗體多數(shù)只能保持天然抗體的活性，且挑選的抗體無(wú)中和抗原生物活性的能力，要挑選中和性抗體是相當(dāng)復(fù)雜和困難的。最后，許多特異性抗體在體內(nèi)并不能夠完全發(fā)揮其預(yù)期的凝集活性；許多優(yōu)良的抗體雜交瘤細(xì)胞株在傳代過(guò)程中穩(wěn)定性不強(qiáng)，容易丟失。再附以制備工作過(guò)程繁瑣拖沓和費(fèi)時(shí)費(fèi)力，使得單克隆抗體技術(shù)的普及一度受限。

單鏈抗體，是在DNA水平上將抗體輕鏈和重鏈可變區(qū)基因用一段適當(dāng)?shù)墓押塑账?Linker)連起來(lái)，使之在適當(dāng)生物體中表達(dá)成為一條單一肽鏈，稱(chēng)為單鏈抗體(SinglechainFv，ScFv)。作為一個(gè)重要基因工程抗體，ScFv更易于在原核細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)和在基因水平進(jìn)行改造。對(duì)ScFv的進(jìn)一步研究中，在取得了重大進(jìn)展的同時(shí)，一些應(yīng)用于臨床出現(xiàn)的問(wèn)題也暴露出來(lái)，如親和力較低，穩(wěn)定性較差，半衰期短等缺點(diǎn)，這些缺點(diǎn)也限制著ScFv在治療過(guò)程中的普及性。

利用兩種不同的單鏈抗體的V_H和V_L基因，使其在表達(dá)過(guò)程中實(shí)現(xiàn)重新組合，形成具有雙特異性的單鏈抗體，這種雙特異性單鏈抗體可以同時(shí)與兩種抗原特異性地結(jié)合。與傳統(tǒng)的雙特異性抗體相比，雙特異性單鏈抗體既保持了特異性結(jié)合抗原的特點(diǎn)，又具有以下優(yōu)點(diǎn)：缺失Fc片段，減少了與FcR陽(yáng)性細(xì)胞發(fā)生非特異性結(jié)合的可能性；最大限度地降低了鼠源性蛋白和免疫變態(tài)反應(yīng)的可能性；分子量小，有利于穿透腫瘤組織；避免了傳統(tǒng)制備雙特異性抗體需要進(jìn)行細(xì)胞雜交的步驟，減少了工作量，提高了制備的成功率。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種多特異性融合抗體，是將來(lái)源于小鼠的4種單鏈抗體的V_H和V_L基因進(jìn)行整合得到，含有8個(gè)抗體重鏈與8個(gè)抗體輕鏈。

所述4種單鏈抗體分別是氯霉素單鏈抗體、環(huán)丙沙星單鏈抗體、磺胺二甲嘧啶單鏈抗體和克倫特羅單鏈抗體。

所述多特異性抗體，包含（a）氯霉素單鏈抗體的V_H和V_L基因片段；（b）環(huán)丙沙星單鏈 抗體的V_H和V_L基因片段；（c）磺胺二甲嘧啶單鏈抗體的單鏈抗體片段；（d）克倫特羅單鏈抗體的單鏈抗體片段；所述片段（a）、（b）、（c）、（d）通過(guò)有別于組裝單鏈抗體基因的連接肽連接。

所述融合抗體包含4個(gè)結(jié)構(gòu)域，第一結(jié)構(gòu)域可與氯霉素的表位結(jié)合，第二結(jié)構(gòu)域可與磺胺二甲嘧啶的表位結(jié)合，第三結(jié)構(gòu)域可與環(huán)丙沙星的表位結(jié)合，第四結(jié)構(gòu)域可與克倫特羅的表位結(jié)合。

編碼所述融合抗體的基因序列為SEQ ID NO:1所示。

獲得所述融合抗體的方法是通過(guò)PCR獲得氯霉素單鏈抗體、環(huán)丙沙星單鏈抗體、磺胺二甲嘧啶單鏈抗體和克倫特羅單鏈抗體的V_H和V_L，并通過(guò)重疊PCR將4個(gè)片段連接起來(lái)，純化后雙酶切、回收、連接到表達(dá)載體pGEX-6P-1，得到重組質(zhì)粒pGEX-CCSC，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，測(cè)序驗(yàn)證后，將重組質(zhì)粒pGEX-CCSC轉(zhuǎn)化DE3在20℃條件下培養(yǎng)表達(dá)融合抗體。

本發(fā)明所提供的多特異性融合抗體具有廣譜特異、低耗高效和靈敏便捷地同步篩檢多種殘留獸藥的優(yōu)點(diǎn)。

附圖說(shuō)明

圖1為構(gòu)建重組蛋白pET-22b-CPFX–ScFv的載體。

圖2為pET--22b-CAP-ScFv不同時(shí)間內(nèi)的誘導(dǎo)表達(dá)SDS-PAGE；

（1：未誘導(dǎo)，2～5：1～4h誘導(dǎo)，6：空載體對(duì)照，7：Marker，8～10：5～7h誘導(dǎo)）。

圖3為pET--22b-CPFX-ScFv不同時(shí)間內(nèi)的誘導(dǎo)表達(dá)SDS-PAGE；

（1：0h，2：1h，3：2h，4：3h，5：4h，6：5h，7：Marker，8、9：空載體對(duì)照）。

圖4為pET--22b-SM₂-ScFv不同時(shí)間內(nèi)的誘導(dǎo)表達(dá)SDS-PAGE；