[發明專利]一種糖化酶及重組表達糖化酶的工程菌株

有效

• 申請號: 201310719904.5
• 申請日: 2013-12-23
• 公開（公告）號: CN103695390A
• 公開（公告）日: 2014-04-02
• 發明（設計）人: 劉士成;吳佳鵬;朱倩倩;黃亦鈞;張慧丹
• 申請（專利權）人: 青島蔚藍生物集團有限公司;山東蔚藍生物科技有限公司
• 主分類號: C12N9/34
• 分類號: C12N9/34;C12N15/56;C12N15/80;C12N1/15;C12R1/885
• 代理公司: 青島海昊知識產權事務所有限公司 37201
• 代理人: 曾慶國

技術領域

本發明屬于功能基因篩選技術領域，具體涉及一種糖化酶及重組表達糖化酶的里氏木霉工程菌株。

背景技術

糖化酶，又稱葡萄糖淀粉酶（Glucoamylase），它能把淀粉從非還原性末端水解α-1，4葡萄糖苷鍵產生葡萄糖。糖化酶的底物專一性較低，它除了能從淀粉鏈的非還原性末端切開α-1，4鍵處，也能緩慢切開α-1，6糖苷鍵。因此，它能很快的把直鏈淀粉從非還原性末端依次切下葡萄糖單位，在遇到1，6鍵時，先將α-1，6鍵分割，再將α-1，4鍵分割，從而使支鏈淀粉水解成葡萄糖。

糖化酶用途廣泛，用于以葡萄糖作發酵培養基的各種抗生素、有機酸、氨基酸、維生素的發酵，還可用于生產各種規格的葡萄糖。凡對淀粉、糊精必需進行酶水解的工業上，都可適用。糖化酶對設備沒有腐蝕，使用安全，且工藝簡單、性能穩定，利用糖化酶對淀粉進行水解比較安全，還有利于實現生產機械化和文明生產。

目前常用的糖化酶均是來自黑曲霉。自70年代中期開始，中科院微生物所篩選獲得了高產糖化酶菌株AS.3.4309。該菌株國內許多大型抗生素制藥廠、酒精廠、釀酒廠進行了生產規模試驗，均獲得成功。該項目的成功為我國發酵行業節約了大量的糧食，產生了巨大的經濟效益和社會效益。市場越來越密切關注高轉化率糖化酶，這使得克隆和表達高轉化率糖化酶成為研究的熱點之一。蛋白表達系統是黑曲霉，其產酶量（蛋白量）較高，但是受到糖化酶本身性質的影響，黑曲霉表達糖化酶的比活比較低，不能適應市場的需求。因此，開發性能優良、比活高的糖化酶越來越受到各方的關注。

發明內容

本發明的目的是提供一種新型糖化酶及重組表達該糖化酶的基因工程菌。本發明將篩選的糖化酶基因轉入里氏木霉（Trichoderma?reesei）中進行表達，構建得到高效表達該糖化酶的重組菌株，顯著提高了糖化酶的產量，有利于糖化酶的廣泛應用。

本發明一方面涉及一種糖化酶，其特征在于，所述糖化酶包括：

a)其氨基酸序列為SEQ?ID?NO:1的酶；

b)其氨基酸序列與SEQ?ID?NO:1相似性高于90%以上，且具有糖化酶功能的酶。

所述糖化酶的編碼基因，其一種核苷酸序列為SEQ?ID?NO:2。

本發明另一方面涉及攜帶有上述糖化酶基因的表達載體。

本發明還提供用于重組表達糖化酶的里氏木霉（Trichoderma?reesei）。

本發明還涉及上述糖化酶的應用。

本發明所述糖化酶在里氏木霉工程菌中得到高效表達，酶活水平達到413U/mL。所述糖化酶的最適作用溫度為75℃，在70℃-80℃范圍內能保持80%以上的酶活；最適作用pH為6.0，且在pH4.0-7.0范圍內，能保持70%以上的酶活。。該糖化酶可廣泛應用于葡萄糖的生產中，2.5h時，其DE值（還原糖值）達到最高為97%；所述糖化酶專一性強，能高效分解α-1,4-糖苷鍵，產物中葡萄糖的含量高達90%。而且所述糖化酶的耐溫性好，所以淀粉液化后可以不用增加降溫步驟，直接加入本發明所述糖化酶進行酶解反應，從而節省工時和能源，更節約了生產成本，市場前景廣闊。

附圖說明

圖1為本發明構建的表達載體質粒圖譜。

圖2為里氏木霉工程菌發酵上清液的SDS-PAGE電泳分析圖，其中箭頭所指為重組表達的糖化酶。

圖3為本發明所述糖化酶作用溫度-相對酶活曲線圖。

圖4為糖化酶VL-2和VL-3作用溫度-相對酶活曲線圖。

圖5為本發明所述糖化酶作用pH-相對酶活曲線圖。

圖6為糖化酶VL-2和VL-3作用pH-相對酶活曲線圖。

具體實施方式

本發明用到了遺傳工程和分子生物學領域使用的常規技術和方法，例如MOLECULAR?CLONING:A?LABORATORY?MANUAL,3nd?Ed.(Sambrook,2001)和CURRENT?PROTOCOLS?IN?MOLECULAR?BIOLOGY(Ausubel,2003)中所記載的方法。這些一般性參考文獻提供了本領域技術人員已知的定義和方法。