[發明專利]一種快速鑒定uORF對翻譯水平影響的方法

無效

• 申請號: 201310719480.2
• 申請日: 2013-12-23
• 公開（公告）號: CN103642931A
• 公開（公告）日: 2014-03-19
• 發明（設計）人: 朱旭君;房婉萍;王玉花;周琳
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/66
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 劉成群;徐冬濤

技術領域

本發明屬于分子生物學領域，具體涉及一種快速鑒定uORF對翻譯水平影響的方法。

背景技術

真核生物mRNA?5′轉錄起始點和開放性閱讀框（open?reading?frame,ORF）的起始密碼子ATG之間的核苷酸序列被稱作5′非編碼區。mRNA5′非編碼區中存在的上游開放性閱讀框(upstream?open?reading?frame,uORF)在基因的翻譯水平上的調控具有重要作用，一些uORF對下游開放性閱讀框有抑制調控作用，而有一部分uORF則控制著mRNA的穩定性^［1］。盡管測序表明，許多真核生物序列中存在uORF對下游開放性閱讀框翻譯的影響研究，但局限于少部分基因。體內和離體實驗表明uORF參與細胞生長調控，特別是通過細胞翻譯能力的調控，一部分uORF能抑制ORF的翻譯，也有一些對ORF影響不大，相反，有一些uORF能促進ORF翻譯。序列中這些uORF對翻譯水平影響的研究，對我們了解翻譯水平的基因表達調控具有重要意義。

Imai等發現^［2］擬南芥acl5基因缺失的轉基因植物表現出植株矮小的癥狀，而且SAC51基因的uORF若提前終止翻譯，則會引起下游開放性閱讀框的翻譯水平上升。Wiese等^［3］研究發現在擬南芥AtbZIP11基因存在蔗糖引起的翻譯抑制(SIRT)特性，且它的抑制翻譯調控依賴于5′未翻譯區域。42個氨基酸編碼的一個uORF片段控制了下游主開放性閱讀框的翻譯作用，從而導致細胞內蔗糖濃度的變化以應對外界環境脅迫。

在瞬時基因表達方法中，基因槍導入法是一種比較快速有效的手段之一。通過基因槍將含有uORF片段的重組質粒DNA，打入植物組織細胞，再測定其相對熒光素酶活性，從而鑒定uORF對其翻譯水平的影響。該方法的應用在分子水平鑒定uORF的作用具有重要作用。

參考文獻：

［1］Tran?M.K.,Schultz?C.J.&Baumann?U.(2008)Conserved?upstream?open?reading?frames?in?higher?plants.BMC?Genomics?9,361.

［2］Imai?A.,Hanzawa?Y.,Komura?M.,Yamamoto?K.T.,Komeda?Y.&Takahashi?T.(2006)The?dwarf?phenotype?of?the?Arabidopsis?acl5?mutant?is?suppressed?by?a?mutation?in?an?upstream?ORF?of?a?bHLH?gene.Development?133,3575–3585.

［3］Wiese?A.,Elzinga?N.,Wobbes?B.&Smeekens?S.(2004)A?conserved?upstream?open?reading?frame?mediates?sucrose-induced?repression?of?translation.The?Plant?Cell?16,1717–1729.

發明內容

本發明的目的在于為鑒定植物基因中uORF片段對翻譯水平的影響問題，提供一種快速鑒定uORF對翻譯水平影響的方法。

本發明的目的是通過下列技術方案實現的：

一種快速鑒定uORF對翻譯水平影響的方法，該方法包括下列步驟：

a.對目的基因的uORF片斷進行擴增，得未突變的uORF片斷；

b.以未突變的uORF片段為模板，對目的基因的uORF片斷進行定點突變并擴增，得突變的uORF片斷；

c.分別將未突變的uORF片斷和突變的uORF片斷構建重組質粒；

d.將上述重組質粒采用基因槍方法分別導入植物組織細胞；

e.培養植物組織細胞（經過22℃溫室培養24小時后），用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測，比較突變型與未突變型的相對熒光素酶活性，鑒定uORF對目的基因翻譯水平的影響，即uORF對下游開放性閱讀框影響。

所述的方法，其中目的基因為AtHsfB1、tbz17或AtPAO3，對應的uORF片段的序列分別為SEQ?ID?No:1，SEQ?ID?No:2，SEQ?ID?No:3。

所述的方法，其中步驟b中定點突變是將Met的密碼子ATG突變為Leu密碼子TTG，或者將ATG突變為CTG或GTG。原理就是不讓啟動子ATG啟動。