[發明專利]基于磁性石墨烯仿酶性質的乙酰膽堿可視化檢測方法

有效

• 申請號: 201310718874.6
• 申請日: 2013-12-23
• 公開（公告）號: CN103712983A
• 公開（公告）日: 2014-04-09
• 發明（設計）人: 王坤;楊興旺;錢靜
• 申請（專利權）人: 江蘇大學
• 主分類號: G01N21/78
• 分類號: G01N21/78
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 樓高潮

1.基于磁性石墨烯仿酶性質的乙酰膽堿可視化檢測方法，按照下述步驟進行：首先，以氧化石墨烯、FeCl₂·4H₂O和FeCl₃·6H₂O為前驅體，采用用二甘醇溶劑熱法合成了具有更好分散性的Fe₃O₄/rGO，進一步探究Fe₃O₄/rGO催化的顯色反應與H₂O₂濃度的對應關系；然后，在乙酰膽堿酯酶和膽堿氧化酶的雙酶體系催化下，乙酰膽堿分解產生H₂O₂；最后，在酶催化反應后的溶液中直接加入Fe₃O₄/rGO，催化乙酰膽堿分解的H₂O₂氧化TMB產生顯色反應，建立乙酰膽堿濃度和溶液顏色吸光度的線性關系，實現乙酰膽堿的比色檢測。

2.根據權利要求1所述的基于磁性石墨烯仿酶性質的乙酰膽堿可視化檢測方法，具體制備步驟如下：

（1）Fe₃O₄/rGO的制備：首先將FeCl₂·4H₂O和FeCl₃·6H₂O加入到含有氧化石墨烯的二甘醇溶液中，其中FeCl₂·4H₂O、FeCl₃·6H₂O和二甘醇溶液的加入量比為：0.5：1：10?mmol/?mmol/mL，氧化石墨烯與二甘醇的用量比為5:10?mg/mL；并在90?oC下攪拌30?min；然后逐滴加入含0.8?M?NaAc的二甘醇溶液，其中含有氧化石墨烯的二甘醇溶液與含NaAc的二甘醇的體積比為1:1；攪拌10?min后，將混合液轉移到反應釜中，200℃下加熱6?h；最后將產品冷卻到室溫，用乙醇洗滌數次后置于50℃真空烘箱中烘干；

（2）H₂O₂濃度與反應體系吸光度的對應關系：首先將965?μL?含有0.5?mg?TMB的醋酸緩沖溶液ABS,?0.2?M,?pH?4.0，分別和10?μL不同濃度0、0.01、0.02、0.1、0.2、1、10、20、40?mM的H₂O₂混合均勻；然后分別加入25?μL?2?mg·mL^–1的Fe₃O₄/rGO，混合均勻后在室溫下溫育15?min；最后，通過外加磁場（磁鐵）去除反應體系中的Fe₃O₄/rGO，拍照觀察顏色變化，并在652?nm波長下分別測量并記錄含不同濃度H₂O₂反應溶液的吸光度，繪制標準曲線；

（3）乙酰膽堿的酶催化反應：將200?μL含有0.5單位的乙酰膽堿酯酶和0.5單位的膽堿氧化酶的磷酸緩沖溶液PBS,?10?mM,?pH?7.4分別與不同量0、5×10^–5、10^–4、5×10^–4、10^–3、10^–2、10^–1、1、10?μmol的乙酰膽堿混合均勻，于37℃下溫育反應30?min；

（4）乙酰膽堿濃度與吸光度的對應關系：800?μL含0.5?mg?TMB和50?μg?Fe₃O₄/rGO的ABS，分別加入到步驟（3）溫育后的溶液中混合均勻，在室溫下溫育30?min；然后，通過外加磁場（磁鐵）去除反應體系中的Fe₃O₄/rGO，拍照觀察顏色變化，并在652?nm波長下測量反應溶液的吸光度；最后，建立乙酰膽堿濃度與吸光度的對應關系并繪制標準曲線。

3.根據權利要求2所述的基于磁性石墨烯仿酶性質的乙酰膽堿可視化檢測方法，其特征在于：步驟（1）中含GO的DEG溶液是在連續超聲2?h條件下制備的均一溶液。

4.根據權利要求2所述的基于磁性石墨烯仿酶性質的乙酰膽堿可視化檢測方法，其特征在于：所述的Fe₃O₄/rGO磁性納米顆粒平均粒徑為10?nm。