[發(fā)明專利]用于檢測B型TEL-ABL融合基因的方法和寡核苷酸

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201310718489.1
• 申請日: 2013-12-23
• 公開（公告）號: CN103757102A
• 公開（公告）日: 2014-04-30
• 發(fā)明（設計）人: 陳奕磊;李文靜;王淑一
• 申請（專利權）人: 成都艾迪康醫(yī)學檢測實驗室有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11;G01N21/64
• 代理公司: 浙江杭州金通專利事務所有限公司 33100
• 代理人: 黎雙華

技術領域

本發(fā)明屬生命科學和生物技術領域，特別是一種用于檢測B型TEL-ABL融合基因的方法和寡核苷酸，采用實時熒光定量PCR技術，可用于檢測人類白血病患者體內(nèi)B型TEL-ABL融合基因是否存在及其表達水平，同時對高危人群進行較為準確的篩查，可有效地節(jié)約檢測時間，提高檢測精度。

背景技術

TEL-ABL（又可稱為ETV6-ABL）融合基因于1995年首次被報道于國外學者Papadopoulos的研究中。TEL基因位于人類12號染色體短臂1區(qū)3帶，ABL基因位于人類9號染色體長臂3區(qū)4帶。這兩種基因融合時可能會產(chǎn)生三種斷裂方式，但在mRNA水平上，最終只會出現(xiàn)兩種轉錄體，即A型融合基因和B型融合基因。這兩種類型的融合基因在ABL端的斷裂位置是一致的，即在A型融合基因和B型融合基因中，ABL端均起始自ABL基因的2號外顯子。不同的是：A型融合基因在TEL端的斷裂位置位于TEL基因的4號外顯子；B型融合基因在TEL端的斷裂位置位于TEL基因的5號外顯子。這樣的融合方式也說明了TEL基因的5號外顯子不是TEL-ABL融合基因導致白血病產(chǎn)生所必需的。

現(xiàn)有的研究已發(fā)現(xiàn)TEL蛋白的HLH結構域可通過寡聚化讓酪氨酸激酶不依賴配體而持續(xù)激活，從而形成血液腫瘤。TEL蛋白的HLH結構域也可與一些轉錄因子形成融合蛋白。TEL-ABL融合基因編碼的TEL-ABL融合蛋白是由TEL蛋白的HLH結構域和ABL蛋白的酪氨酸蛋白激酶活性域嵌合而成的。TEL基因和BCR基因均有使ABL受體酪氨酸激酶寡聚化的能力，因而使得TEL-ABL融合基因的致病機理與BCR-ABL融合基因有些類似：TEL蛋白提供氨基端的HLH結構域，在產(chǎn)生的融合蛋白中HLH結構域的二聚化作用下，使得非受體型酪氨酸激酶ABL基因持續(xù)表達而使細胞惡性增殖，導致白血病發(fā)生。

在已報道的TEL-ABL融合基因陽性病例中，患者的男女比率為2.6:1，平均診斷年齡為48歲，其中多數(shù)患者為慢性髓系白血病（chronic?myeloid?leukemia,CML）患者，其它也包括了急性髓系白血病未分化型（acute?myeloid?leukemia-M1，AML-M1）、慢性骨髓增生瘤（chronic?myeloproliferative?neoplasm，cMPN）及急性淋巴細胞白血病（acute?lymphoblastic?leukemia，ALL）患者。

目前，抑制這種融合基因的有效藥物仍以酪氨酸激酶抑制劑為主（與BCR-ABL融合基因相似）。多篇研究報道了在體外實驗中，酪氨酸激酶抑制劑，如伊馬替尼和尼羅替尼，可以控制TEL-ABL融合基因陽性細胞的生長。即便如此，TEL-ABL融合基因陽性患者的預后仍較不理想。在已報道的TEL-ABL融合基因陽性患者中，死亡率約為65%，而且對ALL幼兒患者而言，TEL-ABL融合基因陽性將會是一個預后不良的指標。因此，對TEL-ABL融合基因進行定量監(jiān)測，是判斷和追蹤該融合基因陽性的白血病患者療效的良好指標，可以較好地反映患者微小殘留病灶(Minimal?Residua?Disease，MRD)的動態(tài)變化。

目前臨床上已經(jīng)將TEL-ABL融合基因作為動態(tài)評估患者病情及預后的手段之一。常用的檢測技術有熒光原位雜交技術(FISH)、逆轉錄PCR(RT-PCR)、實時熒光定量PCR(RQ-PCR)等方法。FISH法盡管結果較為直觀，但是實驗過程繁瑣，涉及試劑種類繁多，費時費力，且結果需經(jīng)驗豐富的專業(yè)人士來判讀，判讀結果存在較大的主觀性。而單純的RT-PCR法則為終點定量，無法對起始模板量進行準確的估算。鑒于MRD是白血病患者復發(fā)的主要原因，因而急需一種高敏感性、高特異性、高自動化程度、污染控制好的方法來對TEL-ABL融合基因mRNA的MRD進行檢測。

RQ-PCR方法具有較高的靈敏度和特異性，而且能對擴增產(chǎn)物進行實時在線檢測，反映TEL-ABL融合基因在樣品中的初始含量，從而節(jié)約了大量的檢測時間，還避免了污染的發(fā)生。常見的實時熒光定量PCR法有SYBR?Green?I染料法，雙探針雜交法以及Taqman探針法等。其中SYBR?Green?I由于是非飽和染料，特異性不如雙探針雜交法以及Taqman探針法，必須通過觀察溶解曲線來判斷其特異性；而雙探針法雜交法成本又較為昂貴。