[發明專利]表皮生長因子重組乳酸菌及其應用

有效

• 申請號: 201310716679.X
• 申請日: 2013-12-23
• 公開（公告）號: CN103710351A
• 公開（公告）日: 2014-04-09
• 發明（設計）人: 馬永;侯景;羅成;姚翔;章成昌;徐春林;陳晨;王耀方
• 申請（專利權）人: 江蘇眾紅生物工程創藥研究院有限公司;常州千紅生化制藥股份有限公司
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/74;C12N1/21;C12P21/02;A23K1/16;A23K1/00;A23L1/29;C12R1/01
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技術領域

本發明涉及生物技術領域，特別涉及一種含有表皮生長因子的乳酸菌，以及經優化的表皮生長因子的編碼基因及其蛋白在重組乳酸菌中表達方法和應用。?

背景技術

動物腸道不僅是動物體內最大的消化吸收器官，是所有營養物質最終的吸收場所，同時也是體內最大的免疫器官，仔豬腸道健康發育是快速生長與高成活率的生理基礎。新生仔豬由于腸道處于快速發育之中，結構與功能不完善，養分的消化吸收與免疫屏障功能有很大的局限性，難以適應營養與環境的變化，增加了飼養的困難。仔豬哺乳期間，初乳和常乳中都含有高水平的、可促進腸道發育和成熟的生長因子，如谷氨酰胺、表皮生長因子、類胰島素生長因子和多胺等，斷奶后，這些因子消失，對腸細胞生長、分化及細胞功能的發育產生不良影響。?

表皮生長因子(epidermal?growth?factor，EGF)是一種非常重要的多肽類生長因子，在維持動物腸道健康中發揮著非常重要的作用。在腸道中，可以調節消化腺的分泌，刺激黏膜增生，影響營養物質的轉運，而且在腸道組織的成熟、再生和修復以過程中都起重要的作用。豬表皮生長因子作為豬乳中含量較高的生長因子之一，它對初生仔豬胃腸道發育有著極其重要影響。早期斷奶是縮短母豬生育周期的重要手段，而早期斷奶導致的斷奶應激是影響早期斷奶仔豬生產性能的主要原因，通過在飼料中添加表皮生長因子可以緩解斷奶應激。盡管豬表皮生長因子憑借其獨特的理化特性以及顯著的生理作用，作為飼料添加劑具有廣闊的發展前景，但是目前生產的豬表皮生長因子都是從乳產品中獲得或利用大腸桿菌表達系統表達所得，這兩種途徑都具有一定的局限性，從乳中分離豬表皮生長因子的量有限，很難滿足市場需要，而利用大腸桿菌表達系統表達的豬表皮生長因子，由于宿主菌大腸桿菌的局限性不能直接作為飼料添加使用，存在著分離純化的難題，增加了成本，很難滿足市場需要。因此，開發出有效的、成本較低的豬表皮生長因子將進一步拓展其在生豬養殖和疾病防御方面的應用。?

乳酸菌（lactic?acid?bacteria，LAB）是一類可發酵碳水化合物并產生大量乳酸的革蘭氏陽性細菌的統稱。它們在自然界分布廣泛，在工業、農業和醫藥行業等與人類生活密切相關的重要領域應用價值很高。乳酸菌在食品工業中應用廣泛，是被公認為安全的（generally?recognized?as?safe，GRAS）食品級微生物。乳酸菌是腸道益生菌，有多種生理功能，如控制腸內感染、抗腫瘤活性等，還能促進小腸局部細胞免疫和體液免疫。利用乳酸菌在腸胃道、?泌尿、生殖系統或粘膜部位粘附存活且無病原性等特點，將其開發成為蛋白多肽類藥物粘膜給藥遞呈載體的研究，受到了廣泛的重視。因此，發明人嘗試采用重組乳酸菌表達豬表皮生長因子，并利用重組乳酸菌作為豬表皮生長因子的藥物呈遞系統應用到生豬養殖和疾病預防領域。但是，發明人經過實驗嘗試直接以基因庫豬表皮生長因子基因轉入重組乳酸菌的方式表達豬表皮生長因子，但是由于種屬差異，豬表皮生長因子的表達量極低，因此需要尋找出更適合的豬表皮生長因子基因。?

發明內容

本發明所要解決的技術問題是：首先，是提供一種更適合于乳酸菌表達系統表達的豬表皮生長因子基因；其次，是開發出有效的、成本較低的表皮生長因子給藥劑型或給藥途徑。?

因此，本發明的一個目的是提供一種編碼重組豬表皮生長因子的基因，所述基因為：?

1）如SEQ?ID?NO：1所示的核苷酸序列；或?

2）與SEQ?ID?NO：1所示的核苷酸序列具有90%以上的同源性且編碼重組豬表皮生長因子的核苷酸序列。?

本發明還提供了一種包含了上述所述編碼重組豬表皮生長因子的基因的質粒。所述的質粒優選為原核表達質粒。最優選為PCYT質粒。?

本發明還提供了一種包含有上述所述質粒的乳酸菌菌株。所述的乳酸菌為乳酸乳球菌、植物乳酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌、瑞士乳桿菌、嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、羅伊氏乳桿菌或發酵乳桿菌。優選地，所述菌株為乳酸乳球菌，更優選的所述菌株為乳酸乳球菌L.lactis?NZ9000。?

本發明還提供了一種重組豬表皮生長因子的表達方法，包括如下步驟：?

1）以上述所述乳酸菌菌株接種培養，加入Nisin進行誘導表達；?

2）收集重組豬表皮生長因子蛋白。?

本發明還提供了上述所述乳酸菌菌株在制備食品及動物飼料中的新用途。?

本發明還提供了一種含有乳酸菌的動物飼料，所述乳酸菌為可表達細胞因子的重組乳酸菌。作為優選的所述乳酸菌為可表達豬表皮生長因子的重組乳酸菌。?