[發明專利]FOXE1基因和WNT3基因的應用及該基因的甲基化擴增引物和探針

無效

• 申請號: 201310715497.0
• 申請日: 2013-12-23
• 公開（公告）號: CN103849680A
• 公開（公告）日: 2014-06-11
• 發明（設計）人: 胡曉彤;何超
• 申請（專利權）人: 浙江大學醫學院附屬邵逸夫醫院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 杭州浙科專利事務所(普通合伙) 33213
• 代理人: 吳秉中

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種FOXE1基因和WNT3基因的應用及該基因的甲基化擴增引物和探針。

背景技術

結直腸癌是我國常見的惡性腫瘤之一，其較高的發病率和死亡率對人類的健康造成了嚴重的威脅。目前結腸鏡對結直腸癌檢查的靈敏度和特異性最高，但由于費用較高、患者痛苦較大和操作要求高等原因降低了患者愿意做該項檢查的程度，致使很多患者拖到晚期。腫瘤標志物具有微創、檢測方便、費用低、便于普查等優點，并具有較高的敏感性和特異性，結直腸癌的發生發展是多種基因損傷的結果，目前還沒找到理想的腫瘤標志物。

基因啟動子過甲基化的本質是一種DNA分子異常，它與腫瘤的發生關系密切，是導致許多腫瘤相關基因表達失活的一個重要原因。在一般正常的細胞中，基因調控區CpG島處于非甲基化的狀態，而當細胞發生癌變后，這些CG區域往往呈現甲基化狀態。目前DNA甲基化研究是腫瘤分子生物學研究的一個重要領域。甲基化和抑癌基因的失活有關，高水平的甲基化常常和腫瘤的高危險性相關，可以用于腫瘤的分類診斷，成為重要的分子生物學標記，異常的基因啟動子甲基化多發生于腫瘤早期，這為大多數腫瘤的早期診斷及判斷腫瘤預后、轉歸、評價療效提供了一個非常有前景的方法。?

發明內容

針對現有技術存在的問題，本發明的目的在于設計提供一種FOXE1基因和WNT3基因的應用及該基因的甲基化擴增引物和探針的技術方案。

所述的FOXE1基因和/或WNT3基因作為甲基化結直腸癌腫瘤標記物的應用。

所述的一種甲基化結直腸癌腫瘤的擴增引物和探針，其特征在于包括FOXE1標記引物和/或WNT3標記引物，

所述的FOXE1標記引物包括引物Foxe1?M-F、引物Foxe1?M-R和探針Foxe1?Probe，所述的Foxe1?M-F序列如SEQ?ID?NO.1所示，所述的引物Foxe1?M-R序列如SEQ?ID?NO.2所示，所述的探針Foxe1?Probe序列如SEQ?ID?NO.3所示；

所述的WNT3標記引物包括引物Wnt3?M-F、引物Wnt3?M-R和探針Wnt3?Probe，所述的引物Wnt3?M-F序列如SEQ?ID?NO.4所示，所述的引物Wnt3?M-R序列如SEQ?ID?NO.5所示，所述的探針Wnt3?Probe序列如SEQ?ID?NO.6所示。

本發明中的FOXE1基因和WNT3基因為現有公開的基因。

本發明通過系統全面地分析Wnt基因及其拮抗基因在結直腸癌細胞株、正常結直腸粘膜、結直腸癌組織及其癌旁正常組織、結直腸癌患者及正常對照DNA中的甲基化狀態，分析其與各臨床資料之間的關系，確定一個具有較高靈敏度和特異性的Wnt/β-catanin通路的甲基化基因譜作為結直腸癌的腫瘤標志物，以便進一步將其開發成為具有獨立自主知識產權的結直腸癌體外診斷試劑盒。

經312例結直腸癌患者和200例正常對照的驗證，已確定FOXE1基因和WNT3基因可以在結直腸癌中作為腫瘤標志物使用，這兩個甲基化腫瘤標志物連用的話敏感性能高達79%，特異性為59%，而且即使I期腫瘤患者的敏感性也能達到63.3%，顯示在全血DNA中尋找甲基化腫瘤標志物的可行性。另外，本發明開發的FOXE1基因和WNT3基因特異性的甲基化擴增引物和探針能夠檢測到2個Wnt通路基因FOXE1和WNT3基因在結直腸癌患者和正常對照全血DNA中的甲基化狀態有顯著性差異。

附圖說明

圖1為甲基化芯片結果顯示部分Wnt通路相關基因在5例結直腸癌患者和5例正常對照者全血DNA中的差異比較圖；

圖2為FOXE1的ddCt平均值在腫瘤患者和正常對照圖；

圖3為WNT3的ddCt平均值在腫瘤患者和正常對照圖。

具體實施方式

以下結合實施例來進一步說明本發明。

實施例

一.材料和方法：

1.材料：正常結直腸粘膜（約50例）取自腸鏡活檢標本，結直腸癌組織及其癌旁正常組織（約300例）取自手術切除標本，所有病例均為初治患者，術前均未行放化療并經病理確診，另外結直腸癌患者（312例）及正常對照（200例）的全血、血清和血漿。結直腸癌患者包括男181例，女131例。年齡38?-?8?2歲，平均61.6?土?12.3歲。?200例健康體檢者入選正常對照組，其中男118例，女82例。年齡21-?71歲，平均年齡40.21土?18.05歲。標本取材獲得患者知情同意并經邵逸夫醫院醫學倫理委員會批準。

2.方法：