[發明專利]支原體培養基及其制備方法

有效

• 申請號: 201310715390.6
• 申請日: 2013-12-20
• 公開（公告）號: CN103667154A
• 公開（公告）日: 2014-03-26
• 發明（設計）人: 陶立;李軍;閉炳芬;黃明學;韋志鋒;潘艷;秦若甫;藍金紅;蘭美益;陳澤祥;楊威;李常挺;梁保新;彭昊
• 申請（專利權）人: 廣西壯族自治區獸醫研究所
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12R1/35
• 代理公司: 廣西南寧公平專利事務所有限責任公司 45104
• 代理人: 楊立華

技術領域

本發明屬于農業微生物技術領域，尤其涉及一種支原體培養基及其制備方法。

背景技術

支原體（Mycoplasma）是一類無細胞壁、介于病毒和細菌間的原核微生物，能引起人和動物的多種疾病，危害極大。該菌DNA分子量比細菌少，生物合成能力較弱，對培養基營養要求較高，生長除依賴基礎營養外，尚需牛心浸液、酵母膏、輔酶Ⅰ、氨基酸等，需要甾醇的支原體，還要加入10%～20%的動物血清。

目前，支原體分離培養常用培養基Hartleys、PPLO、Hayflick，或其他改良的培養基，它們都是以牛心湯為基礎配制而成的，此類培養基成本高，培養時間長、效率低，不利于支原體的大量培養，制約了疫苗生產。因此，研究和探求一種材料易得、價格低廉的支原體培養基變得十分迫切。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種材料易得、價格低廉、培養效果好的支原體培養基及其制備方法，以降低支原體的培養成本，便于實現人工大規模培養支原體。

為解決上述技術問題，本發明采用以下技術方案：支原體培養基，包括基礎培養液，基礎培養液主要由豬肺消化湯、1%水解乳蛋白胨Earle液和25%新鮮酵母浸出液組成。

基礎培養液由豬肺消化湯、1%水解乳蛋白胨Earle液和25%新鮮酵母浸出液按體積百分數48%、50%、2%組成。

上述支原體培養基，還包括動物血清。

每90～95ml基礎培養液中加入5～10ml無菌的動物血清。

動物血清為馬血清或小牛血清。

上述支原體培養基的制備方法，包括以下步驟：

<1>胰腺提取液的制備

取經檢疫合格豬的新鮮胰臟，去除脂肪組織，切碎；500g胰臟加入1500ml?ddH₂O和500ml無水乙醇，室溫振蕩，100rpm；72h后用濾紙過濾即得；

<2>豬肺消化湯的制備

取經檢疫合格豬的新鮮豬肺，去除氣管和淋巴結締組織，切碎，1500g豬肺加入2000ml?ddH₂O，攪拌加熱至80℃，再加入質量濃度0.8%的無水NaHCO₃2500ml，混勻后冷至45℃，加入胰腺提取液500ml、氯仿50ml，混勻置37℃6～7h，之后加濃硫酸40ml，100℃蒸汽加熱1h，紗布過濾，用1mol/L?NaOH溶液調pH至8，100℃蒸汽加熱1h，趁熱濾紙過濾，調節pH值至7.6，121℃高壓滅菌20min，冷卻即得；

<3>1%水解乳蛋白胨Earle液的制備

配制原液甲：NaCl68.0g，KCl4.0g，NaH₂PO₄·2H₂O1.4g，葡萄糖20.0g，將以上各成分溶解于500ml水中，即得；

配制原液乙：NaCl2.0g，MgCl₂·6H₂O1.7g，0.4%酚紅液50ml，將以上各成分溶解于500ml水中，即得；

配制Earle液：原液甲1份，原液乙1份，水18份，混合均勻即得；

將水解乳蛋白胨和Earle液按質量體積比1:100混合完全溶解，裝瓶，115℃高壓滅菌20min，冷卻即得；

<4>25%新鮮酵母浸出液的制備

將250g干面包酵母或啤酒酵母置于1L的ddH₂O中，浸泡1h后加熱至沸騰、冷卻，3000r/min離心20min，取上清液，用1mol/L?NaOH溶液調節pH至8，濾紙初濾后，0.22μl濾膜過濾除菌，即得；

將步驟<2>至<4>獲得的豬肺消化湯、1%水解乳蛋白胨Earle液和25%新鮮酵母浸出液按體積百分數48%、50%、2%在無菌條件下混合，即得基礎培養液。

上述支原體培養基的制備方法，還包括以下步驟：

<5>培養基的完善

根據不同支原體的培養特性，在無菌狀態下，每90～95ml基礎培養液中加入5～10ml無菌的動物血清（馬血清、小牛血清或其他動物血清），混勻，將培養基分裝到試管中，每支試管10ml，-20℃保存。