[發(fā)明專利]重組載體、利用該載體制備的重組桿狀病毒以及該病毒在瘧疾疫苗制備中的應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310714982.6
• 申請日: 2013-12-16
• 公開（公告）號: CN104711288A
• 公開（公告）日: 2015-06-17
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 崔立旺;李偉杰;張耀洲;盛穩(wěn)穩(wěn);閆晶晶;舒特俊;陳劍清;蓋其靜
• 申請（專利權(quán)）人: 特菲（天津）生物醫(yī)藥科技有限公司
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/866;C07K19/00;A61K48/00;A61K39/015;A61P33/06
• 代理公司: 寧波市鄞州甬致專利代理事務(wù)所(普通合伙) 33228
• 代理人: 沈亞芳

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種經(jīng)改造的桿狀病毒載體即重組載體，利用該載體制備的含目的基因（約氏瘧原蟲表面蛋白Pys48基因）的重組桿狀病毒，該重組桿狀病毒的制備方法，該重組桿狀病毒表達(dá)的融合蛋白，以及該重組桿狀病毒和該融合蛋白在瘧疾疫苗制備中的應(yīng)用。?

背景技術(shù)

由媒介蚊蟲傳播的瘧疾是一種嚴(yán)重威脅人類生命健康的感染性疾病。據(jù)2011年WHO《2011年世界瘧疾報告》指出，2010年，在全球106個瘧疾流行國家及地區(qū)共發(fā)現(xiàn)約2.16億病歷，其中86%的瘧疾病歷是5歲以下兒童。瘧疾疫苗的研制和開發(fā)是控制瘧疾傳播的重要策略之一，且隨著越來越多的瘧原蟲耐藥株被發(fā)現(xiàn)，瘧疾疫苗的研制顯的尤為重要，不少瘧疾疫苗已進(jìn)入臨床試驗，現(xiàn)階段，多時期多價疫苗的研制成為瘧疾疫苗研究的熱點。?

約氏瘧原蟲表面蛋白Pys48是其有性生殖階段配子體時期的表面蛋白，其結(jié)構(gòu)高度保守，含有兩段P48-45超家族序列，和其他瘧原蟲的P48蛋白同源性高，常被用作實驗室建立模型為其他瘧疾的研究提供參考。?

目前世界上常用大腸桿菌和酵母表達(dá)蛋白制備疫苗，而用大腸桿菌表達(dá)的蛋白大多數(shù)無免疫原性和保護(hù)性，酵母表達(dá)制備疫苗效果也不是很理想。哺乳細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)（CHO）等表達(dá)系統(tǒng)雖然效果好，但因表達(dá)量低，同時需大量培養(yǎng)基和牛血清蛋白，成本高，不適合生產(chǎn)需要。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對以上現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種重組桿狀病毒載體，利用該載體構(gòu)建表面展示約氏瘧原蟲Pys48抗原的重組桿狀病毒，通過簡單地分離純化病毒粒子，制備抗體具有良好的抗體效價，能夠為P48瘧疾疫苗的研究提供參考。?

本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為：?

一種重組載體pFastBacDual-CMV-Ph-SP-TM，該重組載體由一段重組序列插入到pFastBacDual載體中構(gòu)建而成，所述重組序列為根據(jù)CMV、Ph、SP、TM已知序列，在SP和TM核苷酸序列間加入EcoR?I酶切位點和Xho?I酶切位點，CMV-F前加入KpnI?酶切位點，TM-R后加入HindIII酶切位點形成，所述重組序列全長為923bp，如SEQ?ID?NO：1所示。?

具體地，所述重組序列插入到pFastBacDual載體的KpnI酶切位點和HindIII酶切位點之間。?

本發(fā)明進(jìn)一步提供利用上述重組載體pFastBacDual-CMV-Ph-SP-TM構(gòu)建的重組桿狀病毒BmPys48，該重組桿狀病毒由約氏瘧原蟲Pys48抗原基因插入到重組載體pFastBacDual-CMV-Ph-SP-TM并通過轉(zhuǎn)座與穿梭載體Bacmid的基因組進(jìn)行同源重組，獲得重組桿狀病毒基因組DNA，然后將重組桿狀病毒基因組DNA轉(zhuǎn)染家蠶細(xì)胞，在家蠶細(xì)胞內(nèi)包裝得到表面展示有約氏瘧原蟲Pys48抗原的重組桿狀病毒。?

具體地，所述約氏瘧原蟲Pys48抗原基因插入到重組載體pFastBacDual-CMV-Ph-SP-TM的EcoR?I酶切位點和Xho?I酶切位點之間。?

具體地，所述家蠶細(xì)胞為家蠶BmN細(xì)胞。?

穿梭載體Bacmid（即Baculovirus?plasmid）為帶有桿狀病毒基因組的質(zhì)粒，可在細(xì)菌和昆蟲細(xì)胞之間穿梭，是Bac-to-bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的成員之一，該系統(tǒng)還包括供體質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒及大腸桿菌，為現(xiàn)有技術(shù)。?

載體pFastBacDual是Bac-to-bac表達(dá)系統(tǒng)的供體質(zhì)粒，可以插入外源基因并在輔助質(zhì)粒編碼的轉(zhuǎn)座酶作用下，將外源基因插入到Bacmid中。載體pFastBacDual已經(jīng)商品化；CMV啟動子為哺乳動物啟動子，將其插入桿狀病毒后，桿狀病毒可以在哺乳動物里表達(dá)外源基因。?

上述重組桿狀病毒BmPys48的制備方法，包括以下步驟：?

（1）通過PCR擴(kuò)增的方法得到約氏瘧原蟲Pys48抗原基因，然后將約氏瘧原蟲Pys48抗原基因連接到重組載體pFastBacDual-CMV-Ph-SP-TM的EcoRI酶切位點和Xho?I酶切位點之間，得到重組轉(zhuǎn)座質(zhì)粒pFastBacDual-CMV-Ph-SP-Pys48-TM；?