[發(fā)明專利]一種貨架期內(nèi)具有高活菌數(shù)的枯草桿菌微膠囊的制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310714772.7
• 申請日: 2013-12-23
• 公開（公告）號: CN103704718A
• 公開（公告）日: 2014-04-09
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 童望宇;羅學才
• 申請（專利權(quán)）人: 安徽大學
• 主分類號: A23L1/30
• 分類號: A23L1/30;A61K35/74;A61K9/50;A61P1/12;A61P1/00;C12N1/20;C12R1/125
• 代理公司: 安徽合肥華信知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 34112
• 代理人: 余成俊

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及益生菌微膠囊制備技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是一種貨架期內(nèi)具有高活菌數(shù)的枯草桿菌微膠囊的制備方法。

背景技術(shù)

枯草桿菌?(Bacillus?subtilis)，是一種好氣性革蘭氏陽性菌，有鞭毛。枯草桿菌的內(nèi)生孢子耐高溫（120?°C能存活20?min），耐酸堿(100%直達大小腸的活菌)。進入消化道后，在短期內(nèi)迅速由休眠狀態(tài)復活，繁殖成高含菌量的優(yōu)勢種群。進而消耗掉腸道內(nèi)的氧氣，產(chǎn)生過氧化氫、細菌素，促進有益厭氧微生物的繁殖，抑制有害細菌（大腸桿菌、沙門氏桿菌）的生長，建立微生態(tài)平衡。從而預防腹瀉、下痢等腸胃道疾病。枯草桿菌在臨床醫(yī)學上屬于安全性的有益微生物，在保健食品中屬于益生菌。

益生菌是定植于人體腸道內(nèi)、生殖系統(tǒng)內(nèi)，能產(chǎn)生確切健康功效的生活的有益微生物的總稱。隨著對人們對益生菌了解、重視和研究的深入，益生菌正從保健向醫(yī)療領(lǐng)域延伸。然而，益生菌制品在從生產(chǎn)、保藏、運輸、經(jīng)口服過消化道到達腸道的過程中，需要經(jīng)受一系列不良環(huán)境因素的影響，導致到達腸道的活菌數(shù)量大大減少，限制了益生菌生理功能的發(fā)揮。將益生菌包埋在微膠囊內(nèi)可減輕環(huán)境不良因素的影響，從而提高益生菌的存活率。

可用作微膠囊壁材的材料很多。有天然高分子聚合物、半合成高分子聚合物以及合成高分子聚合物，主要包括：碳水化合物，如海藻酸鈉、殼聚糖、淀粉；植物膠類，如阿拉伯膠、κ-卡拉膠；動物蛋白，如牛奶、明膠；細菌多糖，如膠凝糖、黃原膠。用來包埋益生菌的壁材通常應(yīng)具備如下特征：好的生物相容性和成膜性，合適的粘度、滲透性、親水性和溶解性等；并具有性質(zhì)穩(wěn)定性、能與芯材配合，能生物降解等。對益生菌微膠囊的研究已有諸多報道，但在需氧益生菌微膠囊中還存在有很多不足，如：耐熱性差、透氣性強和存活期短的問題。解決這些問題的主要出路在于提高菌株的抗逆性和膠囊耐受性。

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發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明公開一種貨架期內(nèi)具有高活菌數(shù)的枯草桿菌微膠囊的制備方法，旨在提高枯草桿菌的抗逆性、保藏期，大幅降低活菌經(jīng)過消化道時的死亡率，使盡可能多的活菌到達腸道定植，起到益生保健作用。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案。

一種貨架期內(nèi)具有高活菌數(shù)的枯草桿菌微膠囊的制備方法，其特征在于，包括以下步驟:

（1）?菌株的活化：將4℃左右的條件下保存小于一個月的枯草桿菌單菌落接種于種子培養(yǎng)基中，在32-45?℃，100-300?rpm條件下培養(yǎng)12-24?h進行初次活化，然后按1-5%的接種量第二次將初次活化的枯草桿菌培養(yǎng)液接入種子培養(yǎng)基中，在相同條件下培養(yǎng)4-10?h進行再次活化,得活化種子液；

（2）擴大培養(yǎng)：將活化種子液按1-10%的接種量接種于pH6.5-8.5的裝有的奶粉-豆粕無菌培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，在35-45℃，溶解氧≧35%條件下發(fā)酵18-24?h，繼續(xù)在25-35?℃發(fā)酵18-48?h至內(nèi)生芽孢生成率≧50%，得發(fā)酵液；

（3）洗滌：將發(fā)酵液于3000-10000?rpm速度下離心5-30?min,去除上清液，按體積比1：1-5的比例將沉淀的菌體用無菌水振蕩混均，與前述相同條件下離心去除上清液，反復洗滌1-3次，隨后用1-5%無菌奶粉液重新懸浮菌體，其活菌數(shù)≥10¹⁰?cfu/ml，得菌懸液；

（4）單層微膠囊制備：按1-5%（W/V）的比例將無菌處理的海藻酸鈉、0.1-1%（W/V）的阿魏酸和1-2%（W/V）的甘油加入菌懸液中，無菌條件下充分攪拌混勻，得菌膠液；以10-30?ml/min流速用注射泵將菌膠液注入無菌的1-10?℃冷卻的1-10%（M/V）的氯化鈣溶液中，邊滴加邊在100--300?rpm下攪拌，固化30-60?min，無菌水洗滌三次，得單層濕微膠囊；

（5）雙層微膠囊制備：將所得單層濕微膠囊與用無菌處理的0.5-5%殼聚糖中覆膜30-60?min，無菌水洗滌三次，得雙層濕微膠囊；

（6）干燥保藏：將雙層濕微膠囊進行低溫真空干燥后在無菌條件下進行真空包裝，得枯草桿菌干微膠囊。

述枯草桿菌微膠囊的制備方法，其特征在于，對步驟（5）中所述雙層濕微膠囊進行低溫真空干燥為40?^oC以下的任何一種干燥方式，并真空包裝。

所述枯草桿菌微膠囊的制備方法，其特征在于，步驟（1）中所述的枯草桿菌菌株指的是野生型枯草桿菌、基因工程的枯草桿菌中的一種或兩種。