[發明專利]一種農桿菌介導的甘蔗轉基因方法

有效

• 申請號: 201310714150.4
• 申請日: 2013-12-19
• 公開（公告）號: CN103740751A
• 公開（公告）日: 2014-04-23
• 發明（設計）人: 王繼華;鄭錦榮;曹干;張劍亮;張小蘭;王麗;呂冰
• 申請（專利權）人: 廣東省農業科學院作物研究所
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;A01H4/00;A01H5/00
• 代理公司: 廣州市越秀區哲力專利商標事務所(普通合伙) 44288
• 代理人: 湯喜友

1.一種農桿菌介導的甘蔗轉基因方法，其步驟如下：

1）農桿菌轉化：將含有外源基因的農桿菌培養至對數生長期，收集菌體，重懸于含乙酰丁香酮的MS液體培養基中，得到轉化菌液；?

2）干旱脅迫：酒精表面消毒后切成厚度為0.3～0.5cm的甘蔗葉圓片，在超凈臺上放置15～50分鐘；?

3）浸染：將步驟2）處理后的甘蔗葉片浸泡在步驟1）制備的轉化菌液中，將液體吸干后再將甘蔗葉圓片置于共培養培養基上，于25～30℃暗培養3～4天；

4）生根誘導：將上述經過浸染后的甘蔗葉圓片置于選擇培養基培養，進行再生；待苗高為2～3cm時，切取植株接到生根培養基進行生根誘導，得到生根的植株；

5）煉苗、移栽：將生根的植株煉苗、移栽，得到轉基因甘蔗植株。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟1）的MS液體培養基中乙酰丁香酮的含量為100～250μM。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟3）的共培養培養基為MS培養基與2-5mg/L2,4-二氯苯氧乙酸、1-3mg/L?6-芐氨基嘌呤以及5.5?g/L?瓊脂粉的混合培養基，其pH?5.5。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟4）所述的選擇培養基為MS培養基與2～5?mg/L?2,4-二氯苯氧乙酸、1～3?mg/L?6-芐氨基嘌呤、250mg/L?頭孢霉素、5.5?g/L?瓊脂粉的混合培養基以及抗性標記篩選物質，其pH?5.8；所述的生根培養基為MS培養基與2～5?mg/L萘乙酸、250～500mg/L?頭孢霉素、5.5?g/L?瓊脂粉以及抗性標記篩選物質的混合培養基，其pH?5.8。

5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于：所述抗性標記篩選物質為抗生素或除草劑。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1）中農桿菌采用YEB液體培養基培養，具體步驟為：將含有外源基因的農桿菌接種于含抗生素的YEB液體培養基中，25～30℃搖床過夜，再按體積百分比1%接種量轉接入50mL同樣培養基中培養2～4小時至OD600為0.?5～0.6，收集菌體；然后用5mL含100μM?AS的MS液體培養基重新懸浮沉淀，將菌液轉入50mL含100μM?AS的MS液體培養基中，28℃搖床上培養至OD600到0.5～0.6。

7.根據權利要求1-6任一項所述的方法，其特征在于：所述外源基因為草丁膦抗性基因。

8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟5）中移栽所用的基質為園土和泥炭土按質量比1：1混合。