[發明專利]一種含有藻類的水中“兩蟲”的富集、純化方法及其含量測定方法

在審

• 申請號: 201310713298.6
• 申請日: 2013-12-20
• 公開（公告）號: CN104726337A
• 公開（公告）日: 2015-06-24
• 發明（設計）人: 李紅巖;于建偉;魏魏;安偉;楊敏
• 申請（專利權）人: 中國科學院生態環境研究中心
• 主分類號: C12N1/10
• 分類號: C12N1/10;C12Q1/06;C12R1/90
• 代理公司: 北京元本知識產權代理事務所 11308
• 代理人: 葉凡

1.一種含有藻類的水中隱孢子蟲和賈第鞭毛蟲的富集、純化方法，包括如下順序進行的步驟：

1）加壓處理

對含有藻類的水進行加壓處理，然后靜置放置，獲得上清液；

2）濃縮、富集處理

首先，采用醋酸纖維濾膜對上清液進行過濾；接著將過濾后醋酸纖維濾膜和濾膜截留物加入到丙酮中，溶解、分散，獲得丙酮溶解-分散混合物；然后對丙酮溶解-分散混合物進行離心處理，收集沉淀，獲得“兩蟲”富集沉淀；

3）分離、純化處理

向“兩蟲”富集沉淀中加入磷酸鹽-吐溫緩沖溶液，混勻，制成“兩蟲”懸浮液，接著向懸浮液中加入Percoll-蔗糖介質，進行密度梯度離心處理，離心混合液分為3層，取中間層，即得純化的隱孢子蟲和賈第鞭毛蟲。

2.如權利要求1所述的方法，其特征是：步驟1）中所述含有藻類的水中藻類的濃度≤1×10⁸個藻類細胞/升。

3.如權利要求1或2所述的方法，其特征是，步驟1）中所述加壓處理過程中相對壓力為0.7-1.0MPa。

4.如權利要求1或2所述的方法，其特征是，步驟2）中所述離心處理包括如下處理步驟：

2A）將丙酮溶解-分散混合物進行離心處理，去除上清液，獲得丙酮溶解-分散混合物離心沉淀物；

2B）向丙酮溶解-分散混合物離心沉淀物中加入乙醇和PBS緩沖溶液，混合后獲得乙醇-PBS緩沖混合液，對乙醇-PBS緩沖混合液進行離心處理，去除上清液，獲得“兩蟲”富集沉淀。

5.如權利要求1或2所述的方法，其特征是：步驟3）中所述磷酸鹽-吐溫緩沖溶液按照如下步驟制備而成：

A）按照如下用量備料（以1L水量計）

B）將上述原料加入到純水中，攪拌溶解均勻后定容至1000mL，調節pH到7.2-7.4，制得磷酸鹽緩沖溶液；

C）向磷酸鹽緩沖溶液中加入吐溫80，攪拌混勻，即得，其中每100mL磷酸鹽緩沖溶液中加入0.01-0.2mL的吐溫80。

6.如權利要求1或2所述的方法，其特征是：步驟3）中所述“兩蟲”富集沉淀與所述磷酸鹽-吐溫緩沖溶液的體積之比為1:10-30。

7.如權利要求1或2所述的方法，其特征是：步驟3）中所述Percoll-蔗糖介質的密度為1.10-1.15g/cm³。

8.如權利要求1或2所述的方法，其特征是：步驟3）中加入的Percoll-蔗糖介質與所述“兩蟲”懸浮液的體積之比為1:1-2.5。

9.一種含有藻類的水中“兩蟲”含量的測定方法，包括如下順序進行的步驟：

1）加壓處理

對含有藻類的水加壓后靜置，獲得上清液；

2）濃縮、富集處理

首先，采用醋酸纖維濾膜對上清液進行過濾；接著將過濾后醋酸纖維濾膜和濾膜截留物加入到丙酮中，溶解，分散，獲得丙酮溶解-分散混合物；然后對丙酮溶解-分散混合物進行離心處理，收集沉淀，獲得“兩蟲”富集沉淀；

3）分離、純化處理

向“兩蟲”富集沉淀中加入磷酸鹽-吐溫緩沖溶液，混勻，制成“兩蟲”懸浮液，接著向懸浮液中加入Percoll-蔗糖介質，然后進行密度梯度離心處理，離心混合液分為3層，取中間層，即得純化的隱孢子蟲和賈第鞭毛蟲液；

4）染色、鏡檢

首先，對“兩蟲”純化液進行過濾處理，接著進行染色處理，然后置于顯微鏡下觀察，鏡檢計數。

10.如權利要求9所述的測定方法，其特征是：步驟1）中所述含有藻類的水中藻類的濃度≤1×10⁸個藻類細胞/升。