[發明專利]一種弧菌數量檢測的試劑盒及其制備方法、檢測方法

無效

• 申請號: 201310712163.8
• 申請日: 2013-12-20
• 公開（公告）號: CN103740800A
• 公開（公告）日: 2014-04-23
• 發明（設計）人: 吳月喜;陳玉婷;陳小星;李春震;陳明澤;楊先樂;梁成錦;吳汝泳;吳明;馮學崢;陳桓;梁麗丹;孫玉平
• 申請（專利權）人: 珠海強龍生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/04
• 分類號: C12Q1/04
• 代理公司: 廣州三環專利代理有限公司 44202
• 代理人: 溫旭

技術領域

本發明涉及水產養殖技術領域，具體涉及一種弧菌數量檢測試劑盒及其制備方法、檢測方法，更具體的說是一種用于淡水養殖或海水養殖時檢測水產品或水樣的弧菌數量檢測的試劑盒及其制備方法、檢測方法。?

背景技術

在現有技術中，近年來隨著水產養殖業的快速發展，水產養殖動物病害問題也日益突出，其中細菌性疾病已在世界范圍內對漁業經濟造成了巨大的損失。弧菌是一大群菌體短小、有端極鞭毛、能運動、無芽孢的短桿狀彎曲成弧形的革蘭氏陰性菌，隸屬弧菌科、弧菌屬。大量研究表明，多種弧菌可引起海水養殖魚類、貝類及甲殼類等經濟動物的流行性和暴發性死亡，主要包括副溶血弧菌、創傷弧菌、鰻弧菌、溶藻弧菌、哈維氏弧菌等。弧菌病給水產養殖業造成巨大的經濟損失，并且該病還會導致野生海水魚類、貝類及甲殼類的死亡，進而威脅海洋自然生物資源。例如，在對蝦養殖業種中，弧菌是最主要的細菌性病原，對蝦紅腿病發病率和死亡率達90%；對蝦爛鰓病發病率低，但死亡率很高；急性幼體弧菌病發病后1-2天導致大面積暴發與死亡；對蝦熒光病，特別是對蝦幼體，發病幾天內死亡率為80%-90%，弧菌病一旦蔓延，來勢猛烈。因此，對該病害的預防與控制研究一直備受國內外研究人員的關注，是海水養殖動物病害的主要研究領域之一。在水產養殖中，弧菌病的引起與弧菌數量、水質環境、養殖對象、操作管理等有密切的關系，通過弧菌數量檢測，在很大程度上對弧菌病的預防與控制有重要的意義與作用。?

目前，檢測弧菌數量的常規方法是平板計數法，每次消耗2-3天，培養基保存時間短，難以滿足生產急需性和大面積養殖長期使用；DAN探針技術，技術條件要求高，且只能進行定性分析；熒光定量PCR技術，特異性好，敏感性高，但只能用于實驗室檢測和水體檢測。?

發明內容

本發明所要解決的技術問題在于提供一種操作簡易，檢測時間短，有效預防與控制弧菌病的弧菌數量檢測的試劑盒。?

本發明提供一種弧菌數量檢測的試劑盒，包括弧菌稀釋液和固體培養基；所述弧菌稀釋液為0.009g/ml的氯化鈉溶液；所述固體培養基的配方為：酵母膏3-5g、蛋白胨6-10g、蔗糖12-20g、硫代硫酸鈉6-10g、檸檬酸鈉6-10g、牛膽酸鈉1.8-3g、牛膽粉3-5g、氯化鈉6-10g、檸檬酸鐵0.6-1g、2%溴麝香草酚藍溶液12-20ml、1%麝香草酚藍溶液2.4-4ml、瓊脂9-15g。?

本發明還提供一種弧菌數量檢測的試劑盒的制備方法，包括裝有上述所述弧菌稀釋液的離心管的制備，以及裝有上述所述的固體培養基的培養皿的制備；?

A、裝有所述弧菌稀釋液的離心管的制備包括以下步驟：

A1：稱取9g的氯化鈉倒入已裝入800ml的蒸餾水的燒杯中，攪拌均勻；

A2：在燒杯中倒入鹽酸或氫氧化鈉，將燒杯中的溶液PH值調整到8.5-8.7，再用蒸餾水定容至1000ml，配制成弧菌稀釋液；

A3：通過可調試分離器將步驟A2配制的弧菌稀釋液注入離心管內；

A4：將裝有弧菌稀釋液的離心管滅菌后，旋緊離心管的管蓋，放入真空包裝袋內抽真空；

B、裝有所述固體培養基的培養皿的制備包括以下步驟：

B1：取酵母膏3-5g、蛋白胨6-10g、蔗糖12-20g、硫代硫酸鈉6-10g、檸檬酸鈉6-10g、牛膽酸鈉1.8-3g、牛膽粉3-5g、氯化鈉6-10g、檸檬酸鐵0.6-1g、2%溴麝香草酚藍溶液12-20ml、1%麝香草酚藍溶液2.4-4ml、瓊脂9-15g倒入裝有1100ml蒸餾水的三角燒瓶中，攪拌均勻；

B2：把步驟B1的三角燒瓶在加熱爐上煮沸，制成培養液，并倒入鹽酸或氫氧化鈉，將三角燒瓶中的溶液PH值調整到8.5-8.7；

B3：將步驟B2制得的培養液滅菌后，冷卻至55℃-65℃；

B4：在超凈臺內對自動分液器的儲液漏斗消毒，然后將步驟B3冷卻至55℃-65℃的培養液分裝到培養皿中；

B5：將培養皿平放于超凈臺上，并打開超凈臺紫外燈，使培養液冷卻凝固成固體培養基；

B6：凝固后，在超凈臺內，將培養皿的蓋子蓋上，倒扣后將培養皿取出，放入真空包裝袋抽真空。

進一步地，在裝有所述弧菌稀釋液的離心管的制備過程中，往每個離心管內加入0.9ml的弧菌稀釋液，每個真空包裝袋裝有2支離心管；在裝有所述固體培養基的培養皿的制備過程中，用90mm的培養皿接住20ml培養液，每個真空包裝袋含有1塊裝有固體培養基的培養皿。?