[發(fā)明專利]一種用于哺乳動(dòng)物核酸樣品質(zhì)量控制的引物、探針及分子檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310711918.2
• 申請(qǐng)日: 2013-12-20
• 公開（公告）號(hào): CN103642930A
• 公開（公告）日: 2014-03-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王成明;危藍(lán)菁;張繼壘;楊奕;張真穩(wěn);郁多男;陶建平;楊章平;郝永清;徐達(dá);陸光武;莊林林
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 揚(yáng)州大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 南京知識(shí)律師事務(wù)所 32207
• 代理人: 盧亞麗

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明建立了一套基于羥甲基膽色烷合成酶基因、適用于所用哺乳動(dòng)物PCR質(zhì)量控制的內(nèi)源基因系統(tǒng)。該系統(tǒng)能高度敏感、特異地?cái)U(kuò)增來自9個(gè)國(guó)家(津巴布韋，尼加拉瓜，哥斯達(dá)尼加，多米尼格，格林納達(dá)，蒙特塞拉特，尼維斯，圣基茨，中國(guó))的、人和12種哺乳動(dòng)物(猴,貓,狗,牛,驢,山羊,綿羊,馬,豹子,獅子,豬和老虎)的核酸、二種小鼠品系的11種組織器官(心臟、肝臟、腦、脾臟、肺臟、脂肪、腎臟、肌肉、毛發(fā)、骨、皮膚)的核酸，而不擴(kuò)增細(xì)菌、寄生蟲、病毒、食用植物油的核酸。此外，本發(fā)明設(shè)計(jì)的擴(kuò)增片斷包含的一段基因序列區(qū)，所有哺乳動(dòng)物在該區(qū)有顯著差異，測(cè)序此區(qū)可快速方便地鑒定哺乳動(dòng)物的種類。

背景技術(shù)

PCR技術(shù)自1986年發(fā)明以來，已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、生物學(xué)和農(nóng)業(yè)科學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域，由于其無與倫比的高度特異性和敏感性，PCR技術(shù)成為現(xiàn)代分子檢測(cè)學(xué)的必不可少的核心組成部分。而PCR結(jié)果的可信性很大程度上依賴于待檢樣品的核酸水平和質(zhì)量。影響最終待檢樣品中核酸的質(zhì)量和水平的因素包括：1)樣品采集。采集的樣品中目的核酸的含量、樣品的采集過程以及采集緩沖液和抗凝劑的選擇；2）樣品的儲(chǔ)存和運(yùn)輸。樣品的不科學(xué)的儲(chǔ)存和處理、反復(fù)凍融、溶血等會(huì)引起核酸的降解；3）樣品的核酸提純。不恰當(dāng)?shù)暮怂崽峒兎绞健埩鬚CR抑制劑等都會(huì)影響樣品的質(zhì)量。為此，科學(xué)家們成功地建立了一種在樣品中添加外部控制基因的辦法來監(jiān)控待檢樣品核酸提純效率等而確保PCR的可信度。然而，加入外源性控制基因的手段不能監(jiān)控樣品采集、運(yùn)輸、保存等環(huán)節(jié)上出現(xiàn)的核酸降解和污染等問題。目前世界范圍內(nèi),還沒有一個(gè)全程監(jiān)控待檢樣品的核酸水平和質(zhì)量并方便地用于PCR質(zhì)量控制的系統(tǒng)。因此，亟需建立一種能夠有效及全程地監(jiān)控從樣品采集到核酸提純等環(huán)節(jié)的質(zhì)量控制系統(tǒng)，從而確保PCR結(jié)果的可信度。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明提供一種基于羥甲基膽色烷合成酶基因的哺乳動(dòng)物核酸定量和分型的分子檢測(cè)方法，使用本發(fā)明可以方便、有效地監(jiān)控在樣品采集、運(yùn)輸、保存、提取等任何環(huán)節(jié)出現(xiàn)的潛在問題，為提高PCR的可信度、降低其假陰性報(bào)告率等提供技術(shù)支持。

本發(fā)明的原理和最核心的思路是發(fā)明一種高度靈敏的、可以用于任何哺乳動(dòng)物PCR系統(tǒng)的外源性基因控制系統(tǒng)。確保此系統(tǒng)不擴(kuò)增非哺乳動(dòng)物以外的核酸，如細(xì)菌、病毒、寄生蟲和植物等。本發(fā)明選擇了一個(gè)相對(duì)保守的看家基因（羥甲基膽色烷合成酶）作為目標(biāo)基因，此基因主要存在于哺乳動(dòng)物,而不存在于植物和細(xì)菌等微生物。總體的思路是：巧妙地設(shè)計(jì)一對(duì)引物和探針，特異地?cái)U(kuò)增所有哺乳動(dòng)物的核酸；此PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的羥甲基膽色烷合成酶基因在哺乳動(dòng)物中高度多樣性的區(qū)域（90個(gè)核酸在哺乳動(dòng)物中的相似率僅為19%，圖1）。因此，PCR擴(kuò)增后對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行基因測(cè)序可以方便地確定哺乳動(dòng)物的種類；此設(shè)計(jì)測(cè)試不同種類和來源的核酸樣品，而保證其高度的特異性和敏感性。

從GenBank（www.ncbi.nlm.nih.gov）獲取如下羥甲基膽色烷合成酶基因的序列后，用Clustal?Multiple?Alignment?Algorithm的方法對(duì)所有序列進(jìn)行比對(duì)（如圖1所示）：人：NG_008093,猴子：NC_007871,狗：NC006587,貓：NC_018732,牛：AC000712,羊：NC019472,豬：NC_010451,馬：NC_009150,小鼠：NC_000075,大鼠：NC_005107。據(jù)此，本發(fā)明設(shè)計(jì)的引物和探針為：

上游引物-1：5’-TACCTGACTGGAGGAGTCTGGAGTCT-3’（SEQ?ID?NO.1）

上游引物-2：5’-GCCAGGCTGATGCCCAGGTTCT-3’（SEQ?ID?NO.2）

6-FAM探針:5’-AGCAHGAAGATGGYCCWGA-6-FAM-3’（SEQ?ID?NO.3）

LCRed640探針：5’-LCRED640-GATGAYCCACAGCTGGTRG-Phosphate-3’（SEQ?ID?NO.4）。

本發(fā)明還公開了用于哺乳動(dòng)物核酸樣品質(zhì)量控制分子檢測(cè)方法，即用上述引物和探針對(duì)核酸樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)PCR過程中熒光強(qiáng)度的變化，以及PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳的條帶大小，對(duì)核酸樣品進(jìn)行定量或/和分型。