[發明專利]一種催化碳-氟和碳-氯鍵形成的鹵化酶

無效

• 申請號: 201310710496.7
• 申請日: 2013-12-20
• 公開（公告）號: CN103695384A
• 公開（公告）日: 2014-04-02
• 發明（設計）人: 瞿旭東;王婭婭;鄧子新
• 申請（專利權）人: 武漢大學
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12N15/54;C12P19/40
• 代理公司: 武漢科皓知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 42222
• 代理人: 汪俊鋒

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技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及通過基因重組技術獲得具有催化C-F鍵和C-Cl鍵形成的鹵化酶。

背景技術

鹵化酶是一大類能催化鹵素離子（包括F^-，Cl^-，Br^-，I^-）形成穩定碳鹵鍵的酶，從催化的機制來分可以分為血紅素依賴、黃素依賴、酮戊二酸依賴、釩依賴以及SAM依賴的鹵化酶（C.?T.?Walsh,?Chemistry?&?Biology,?2008,?15,?99-109），其中又以能催化形成C-F鍵的鹵化酶尤為重要。

有機氟化合物被廣泛應用于藥物，醫學檢測，農藥以及材料，在藥用化合物中引入氟原子往往能提高藥物的活性及穩定性。據統計，大約有20?%-30?%的商品藥含有氟原子(T.?Furuya,?et?al.,?Nature,?2011,473,?470-477)，因此，有機含氟化合物越來越被人們所重視。然而，自然界中存在的含氟有機物數量少之又少，只在非洲大陸的少數植物和鏈霉菌Streptomyces?cattleya體內發現少量的高毒含氟化合物。究其原因，是因為在自然界中，CaF₂等含氟無機物溶解性很差，絕大多數是以沉淀的形式存在，因此，氟元素不能被生命體很好的利用。當前，僅僅依靠所發現的極少量的天然含氟有機化合物，是遠遠不能滿足生產和生活的需求的。盡管過去幾十年，人們已經開發出一些化學合成有機含氟化合物的方法，但由于氟原子的特殊化學性質，使得這些方法往往要在苛刻、高毒的化學環境中才能完成有機化合物的氟化，而且選擇性也不盡人意。

與化學合成相比，酶催化合成的具有催化條件溫和，選擇性高，綠色環保等優點。目前，酶催化技術已經被廣泛應用于化學品，醫藥中間體的生產。其發展潛力巨大。目前，已知催化氟離子形成C-F鍵的鹵化酶（fluorinase，E.C.2.5.1.63）僅有一例：2002年，O’Hagan等人報道了從鏈霉菌S.?cattleya分離的鹵化酶FlA能催化F^-和SAM形成5’-FDA(O’Hagan,?et?al.,?Nature,?2001,?416,?279)。通過進一步對FlA純化和晶體解析，該研究表明，連接N端和C端的環形區域（loop）為F^-?和SAM提供反應所必須的空間區域。FlA第158位的絲氨酸殘基對F^-的結合和去溶劑化起到了關鍵的作用，使得F^-能夠選擇性親核進攻SAM的5’位，形成5’-FDA。

發明內容

????本發明所要解決的技術問題在于提供一種催化碳-氟和碳-氯鍵形成的鹵化酶。

為達到上述目的，本發明采用以下技術手段：

首先，以來源于巴西諾卡菌的鹵化酶基因為原始基因，根據鹵化酶基因在大腸桿菌體內表達的密碼子偏好，進行優化，合成以大腸桿菌為表達宿主的優化鹵化酶基因序列；

其次，將優化鹵化酶基因序列重組到克隆載體pUC57?simple，經NdeI和HindⅢ?雙酶切之后，連接到具有同樣內切酶位點的表達載體pET28a(+)片段上，獲得表達載體pWHU2401；

最后，將表達載體pWHU2401轉化大腸桿菌感受態細胞，獲得能夠異源表達鹵化酶的工程菌，放大發酵，純化，從而獲得鹵化酶。

本發明還對獲得的鹵化酶的性能進行了測定，包括最適pH，米氏常數K_m，轉化常數k_cat和對除F^-以外的其他鹵素離子的活性。測定結果顯示，我們獲得的鹵化酶能夠特異性合成5’-氟5’-脫氧腺嘌呤核苷（5’-FDA），催化活性跟已知的鹵化酶FlA活性相當。在加入L-氨基酸氧化酶時，該鹵化酶也能催化形成5’-氯-5’-脫氧腺嘌呤核苷（5’-ClDA）。

本發明中，我們利用基因工程的方法，克隆了來源于巴西諾卡菌的新穎鹵化酶基因nobA，通過蛋白表達我們獲得了高活性的鹵化酶，體外活性測試證實了其能催化氟離子和S-腺苷甲硫氨酸（SAM）形成5’-FDA（圖2）。此外，在氨基氧化酶的存在下，我們發現，NobA還可以催化氯離子和和SAM形成5’-ClDA（圖5）。這一發明報道了有史以來的第二例催化碳-氟鍵形成的鹵化酶，填補了國內關于這類酶研究的空白。

附圖說明