[發明專利]一種生物醫學分子克隆方法

在審

• 申請號: 201310706163.7
• 申請日: 2013-12-19
• 公開（公告）號: CN104109685A
• 公開（公告）日: 2014-10-22
• 發明（設計）人: 張建亮;薛奮勤;閆紅霞;趙君君;楊慧
• 申請（專利權）人: 首都醫科大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/66
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢

技術領域

本發明屬于基因工程領域，涉及一種分子克隆方法。

背景技術

分子克隆是生物醫學實驗室最常用的方法之一。傳統的分子克隆先用PCR擴增基因片段，然后通過T4DNA連接酶把限制性內切酶消化后的載體和基因DNA片段連接起來。盡管這是一個被廣泛應用的方法，但它涉及到很多操作步驟，費時費力。也由于操作步驟較多，使得在基因克隆中一旦出現問題則很難排查問題所在。

由于在傳統的分子克隆中遇到的種種問題，在過去幾十年的時間里，人們試圖研發更簡單、高效的克隆方法，這些方法包括：TA克隆、不需連接反應的克隆方法（ligation-independent?cloning?method，LIC）和GATEWAY重組克隆方法。但是，這些方法都有自己的局限性。比如，TA克隆是用常規的Taq?DNA聚合酶在PCR產物的末端加一個3’-A接頭，然后把PCR產物直接克隆在一個帶有互補的具有3’-T接頭的TA克隆載體上。這種方法的缺點是Taq?DNA聚合酶的保真度很低，極容易產生一些非目的的突變，而且它還需要二次克隆，即通過限制性內切酶和連接酶把目的DNA克隆到目的表達載體上。對于早期的不需連接反應的克隆方法（LIC），它是利用T4DNA聚合酶上3’-核酸外切酶的活性，在插入片段末端和載體末端各產生一個相互互補的15bp的5’接頭。這種方法需要一些特定的序列來產生15bp接頭。對于GATEWAY重組克隆方法，它是用特定位點的重組技術把供體載體的目的基因轉移到目的載體上，過程繁瑣。

最近還有一些無需連接反應的分子克隆試劑盒相繼問世，如CloneEZ試劑盒（GenScript?USA?Inc.，Piscataway，NJ，USA）、一步克隆試劑盒、重疊延伸PCR克隆試劑盒等。對于CloneEZ克隆試劑盒，它仍然需要對酶切的載體和PCR擴增產物進行純化，即需要購買相應的純化試劑盒及克隆試劑盒。同樣，重疊延伸PCR克隆法，它還需要對第一輪PCR產物（包括載體和插入片段）和第二輪重疊延伸的PCR產物進行純化，且在第二輪的重疊延伸PCR時，為了要產生載體和插入片段的連接體，它通常也產生很多雜帶。一步快速克隆法盡管不需要對PCR產物進行純化，但是它需要兩次的連續35個循環的PCR，總共進行70次循環擴增。第一次35個循環PCR是為了擴增插入片段和線性化載體，第二次35個循環PCR是為了通過重疊延伸，把載體和插入片段組裝成一個單一的線性PCR產物。而且，上述方法仍然還需要購買相應的純化試劑盒及克隆試劑盒，費時費力費錢。

發明內容

本發明的目的是提供一種簡單快速的分子克隆方法。

本發明所提供的分子克隆方法，具體可為如下三種中的任一種：

第一種：在出發質粒的位點1處插入目的基因得到重組環形質粒的方法，為如下（A）或（B）：

（A）當所述目的基因大于120bp且小于3000bp時，所述方法具體可包括如下步驟：

（1）引物設計：

根據所述出發質粒上所述位點1上游的序列設計用于擴增質粒骨架的反向引物1，根據所述出發質粒上所述位點1下游的序列設計用于擴增質粒骨架的正向引物1；

根據待插入的所述目的基因的序列設計用于擴增所述目的基因的正向引物2以及反向引物2；

所述反向引物1的5’端和所述正向引物2的5’端有15-17個核苷酸序列反向互補（具體堿基含量可根據引物中GC含量確定）；所述正向引物1的5’端和所述反向引物2的5’端有15-17個核苷酸序列反向互補（具體堿基含量可根據引物中GC含量確定）；

其中，所述反向引物1和所述正向引物2中反向互補的15-17個核苷酸序列既可對應所述出發質粒上所述位點1上游的序列，也可對應所述目的基因的5’端的序列。所述正向引物1和所述反向引物2中反向互補的15-17個核苷酸序列既可對應所述出發質粒上所述位點1下游的序列，也可對應所述目的基因的3’端的序列。

（2）PCR擴增：

以所述出發質粒為模板，在具有3’-5’核酸外切酶活性的DNA聚合酶作用下，用所述正向引物1和所述反向引物1進行PCR擴增，得到PCR反應產物1；

以含有所述目的基因的DNA為模板，在具有3’-5’核酸外切酶活性的DNA聚合酶作用下，用所述正向引物2和所述反向引物2進行PCR擴增，得到PCR反應產物2；

（3）Dpn?I消化及轉化